탈락막에서 IL-15와 그 수용체의 발현

임신초기 말초혈액과 탈락막의 림프구에서 IL-15와 IL-15Rα의 발현

1. 검체 수집 D&C 절차 중 다산으로 인해 재태 연령이 6-8주인 20-30명의 임산부로부터 말초 혈액 및 탈락막 조직을 수집합니다.
2. 탈락막 조직의 면역조직화학적 염색 탈락막 조직의 동결 절편을 권장 절차에 따라 수행했습니다. 제1항체, 마우스 항인간 IL-15 또는 IL-15Rα 단클론항체, 제2항체, 퍼옥시다제 표지 염소 항마우스 다클론항체, 발색시약을 순차적으로 첨가하였다. 마지막으로 슬라이드를 헤마톡실린으로 역염색했습니다.
3. 단핵 세포의 분리 낙태 시 각 임산부로부터 탈락 조직 및 말초 혈액 샘플을 채취했습니다. 혈액에 의한 오염을 최소화하기 위하여 탈락막 조직을 융모막 융모로부터 육안으로 분리하고 Hank's balance salt solution으로 2회 세척한 후 잘게 잘라서 다시 2회 세척한 후 1.9 mm 메쉬를 통과시켜 잔류혈액을 제거하였다. 효소 처리. 그런 다음 이 샘플을 45.7μm 스테인리스 스틸 메쉬를 통해 여과하여 조직 파편을 제거했습니다. 여과된 용액을 Ficoll-Paque PLUS 구배 위에 층을 이루고 400g에서 45분 동안 원심분리했습니다. 단핵 세포의 농축된 세포 현탁액을 계면에서 수집한 후 RPMI-1640 배지로 2회 세척하였다. 말초 혈액 단핵 세포도 Ficoll-Paque PLUS 침강에 의해 분리되었습니다.
4. 세포측정 분석 단핵 세포에서 세포내 IL-15 및 표면 IL-15Rα의 발현을 유동 세포측정으로 분석하였다. 항체 조합은 다음을 포함하였다: FITC/PE/PerCP-CD4/IL-15/CD3, CD8/IL-15/CD3, CD56/IL-15/CD3, CD4/IL-15Rα/CD3, CD8/IL-15Rα/CD3 , CD56/IL-15Rα/CD3.
5. CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 NK 세포의 분리 말초 혈액 및 탈락막의 CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 NK 세포를 MACS(Magnetic Activated Cell Sorter)로 각각 분리하였다.
6. IL-15 및 IL-15Rα mRNA의 실시간 PCR CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 NK 세포의 총 RNA를 Trizol로 추출하고 역전사를 통해 cDNA로 형질전환시켰다. Real-time PCR은 ABI PRISM 7700 Sequence Detector System으로 ß-actin, IL-15 및 IL-15Rα에 대한 서로 다른 프로브를 사용하여 수행되었습니다. 프라이머 서열은 다음과 같다: ß-액틴, 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA; 5' CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC; IL-15, 5' GGC TTT GAG TAA TGA GAA TTT CGA; 5' ATC AAT TGC AAT CAA GAA GTG TTG; IL-15Rα, 5' GGC GAC GCG GGG CAT CAC; 5' TCG CTG TGG CCC TGT GGA 타.

7. CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 NK 세포의 기능 검사

   1. 증식 검정 세포 증식 동안 BrdU의 혼입을 사용하여, 상이한 농도의 IL-15 및 IL-2가 첨가되었을 때 CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 NK 세포의 증식 능력을 평가하였다.
   2. 분비 분석 상이한 농도의 IL-15 및 IL-2가 배양 배지에 첨가될 때 ELISA 키트를 사용하여 상청액 내의 IFN-γ, IL-6 및 IL-10의 농도를 검출하였다.
   3. 형광 기반 세포 독성-FCC 분석 표적 세포의 NK- 및 CTL-매개 세포용해는 세포사멸의 한 형태를 구성하며 카스파제 활성화를 포함하여 많은 동일한 현상을 동반합니다. 우리는 caspase 6에 대한 fluorogenic 기질을 표적 세포 (K562 세포와 autologous cytotrophoblasts)에 통합하고 절단 기질에서 방출되는 형광을 감지하여 caspase 활성화를 측정했습니다.

자가 자궁내막과의 공동배양 전과 후의 인간배아에서의 IL-15와 IL-15Rα의 발현

1. 인간 배아의 면역세포화학적 염색 IVF 프로그램에서 얻은 인간 배아를 얼음처럼 차가운 고정 완충액으로 부착 슬라이드에 고정했습니다. phycoerythrin-conjugated anti-IL-15 monoclonal antibody 또는 biotinylated anti-human IL-15Rα antibody와 streptavidin-fluorescein isothiocyanate (SAv-FITC) Conjugate를 첨가하였다. fluoroscope는 대상에서 방출되는 형광을 감지하는 데 사용되었습니다.
2. IL-15 및 IL-15Rα mRNA의 단일 세포 PCR 비오틴/스트렙타비딘 "포획" 원리를 사용하여 Micro RNA Isolation Kit로 배아 mRNA를 분리하고 비오틴 표지 올리고 dT 프로브로 표지한 후 스트렙타비딘 코팅된 튜브. cDNA로 변환한 후, 위에서 설명한 대로 ABI PRISM 7700 Sequence Detector System을 사용하여 ß-액틴, IL-15 및 IL-15Rα에 대한 서로 다른 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행했습니다.
3. 자가 자궁내막 세포의 분리 Pipelle Endometrial Suction Curette로 환자의 IVF 절차 전 주기에서 황체기 자궁내막 생검을 수행했습니다. 조직을 0.2% 콜라게나제 2형으로 분해하고 단위 중력에서 차등 침강에 의해 침강시켰다. 위의 과정을 4번 반복하여 상등액을 모았다. 단위 중력에서 차등 침강 후 기질이 풍부한 분획을 포함하는 상청액을 향후 사용을 위해 조직 배양 플라스크로 옮겼습니다. 4회 분해 후 남은 조직 조각을 10mL HBSS에 재현탁했습니다. 약 30초 후, 상위 8mL가 단위 중력에서 가라앉도록 했습니다. 선이 풍부한 분획을 포함하는 이 침전물을 RPMI에 재현탁하고 향후 공동 배양을 위해 조직 배양 플라스크에 도금했습니다.
4. 인간 배아의 자가 자궁내막 공동 배양 환자의 IVF 주기 동안 hCG 투여 전 추정일에 대략 동량의 선상 세포와 간질 세포가 혼합되었습니다. 약 3x10^5개의 세포를 4웰 조직 배양 플레이트에 시딩하고 접합체를 공동 배양 시스템 또는 기존 배지(인간 난관액 + 15% 모체 혈청)에 넣었습니다. 절단율 및 형태학적 외관을 매일 평가하였다. 형태학적으로 가장 좋은 배아는 배양 시스템에 관계없이 회수 후 72시간 후에 환자에게 다시 이식되었습니다. 착상율은 이식된 배아 수당 태아 심장 활동이 있는 자궁내 주머니의 수로 정의되었습니다. 임상 임신에는 49일까지 경질 초음파에서 기록된 태아 심장 박동이 있는 임신만 포함되었습니다.
5. 공동 배양 배지에서의 사이토카인 분포 Th1 사이토카인(IL-2 및 IFN-γ), Th2 사이토카인(IL-4, IL-6 및 IL-10) 및 IL-15를 포함하는 사이토카인은 배아 도금 전후의 공동 배양 배지.
6. 인간 자궁내막 선상 및 기질 세포의 면역세포화학적 염색 정제된 자궁내막 선상 및 기질 세포를 차가운 Wash Buffer로 2회 세척하여 세포에 부착된 사이토카인을 제거하였다. 그런 다음 이 세포를 얼음처럼 차가운 고정 완충액으로 접착 슬라이드에 고정했습니다. phycoerythrin-conjugated anti-IL-15 monoclonal antibody 또는 biotinylated anti-human IL-15Rα antibody와 streptavidin-fluorescein isothiocyanate (SAv-FITC) Conjugate를 첨가하였다. fluoroscope는 대상에서 방출되는 형광을 감지하는 데 사용되었습니다.
7. 인간 자궁내막 선상 및 간질 세포로부터의 IL-15 및 IL-15Rα mRNA의 실시간 PCR 자궁내막 선상 및 간질 세포의 총 RNA를 Trizol로 추출하고 역전사를 통해 cDNA로 형질전환시켰다. 실시간 PCR은 위에서 설명한 대로 ABI PRISM 7700 Sequence Detector System을 사용하여 ß-액틴, IL-15 및 IL-15Rα에 대한 서로 다른 프로브를 사용하여 수행되었습니다.