Die Expression von IL-15 und seinem Rezeptor in Decidua

Die Expression von IL-15 und IL-15Rα in den Lymphozyten des peripheren Blutes und der Dezidua während der frühen Schwangerschaft

1. Probenentnahme: Aufgrund der Multiparität werden während des D&C-Eingriffs peripheres Blut und Dezidualgewebe von 20–30 schwangeren Frauen im Gestationsalter von 6–8 Wochen entnommen.
2. Immunhistochemische Färbung des Dezidualgewebes Der Gefrierschnitt des Dezidualgewebes wurde gemäß den empfohlenen Verfahren durchgeführt. Der erste Antikörper, der monoklonale Maus-Anti-Human-IL-15- oder IL-15Rα-Antikörper, der zweite Antikörper, der Peroxidase-markierte polyklonale Ziegen-Anti-Maus-Antikörper und die Farbreagenzien wurden nacheinander hinzugefügt. Abschließend wurden die Objektträger mit Hämatoxylin gegengefärbt.
3. Trennung mononukleärer Zellen Zum Zeitpunkt der Abtreibung wurden von jeder schwangeren Frau Dezidialgewebe- und periphere Blutproben entnommen. Um die Kontamination durch Blut zu minimieren, wurde das Dezidualgewebe makroskopisch von den Chorionzotten getrennt, zweimal mit Hanks ausgewogener Salzlösung gewaschen, in kleine Stücke geschnitten, noch einmal zweimal gewaschen und durch ein 1,9-mm-Netz geführt, um das restliche Blut zu entfernen enzymatische Behandlung. Diese Proben wurden dann durch ein 45,7-μm-Edelstahlnetz filtriert, um Gewebereste zu entfernen. Die filtrierte Lösung wurde über einen Ficoll-Paque PLUS-Gradienten geschichtet und 45 Minuten lang bei 400 g zentrifugiert. An der Grenzfläche wurde eine angereicherte Zellsuspension mononukleärer Zellen gesammelt und dann zweimal mit RPMI-1640-Medium gewaschen. Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes wurden ebenfalls durch Ficoll-Paque PLUS-Sedimentation isoliert.
4. Zytometrische Analysen Die Expression von intrazellulärem IL-15 und Oberflächen-IL-15Rα in mononukleären Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Zu den Antikörperkombinationen gehörten: FITC/PE/PerCP-CD4/IL-15/CD3, CD8/IL-15/CD3, CD56/IL-15/CD3, CD4/IL-15Rα/CD3, CD8/IL-15Rα/CD3 , CD56/IL-15Rα/CD3.
5. Trennung von CD4+-Zellen, CD8+-Zellen und NK-Zellen Die CD4+-Zellen, CD8+-Zellen und NK-Zellen im peripheren Blut und in den Deziduae wurden jeweils mit einem magnetisch aktivierten Zellsortierer (MACS) getrennt.
6. Echtzeit-PCR von IL-15- und IL-15Rα-mRNA Die Gesamt-RNA in CD4+-Zellen, CD8+-Zellen und NK-Zellen wurde mit Trizol extrahiert und mit reverser Transkription in cDNA transformiert. Die Echtzeit-PCR wurde mit verschiedenen Sonden für ß-Actin, IL-15 und IL-15Rα mit dem ABI PRISM 7700 Sequence Detector System durchgeführt. Die Primersequenzen waren: ß-Actin, 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA; 5' CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC; IL-15, 5' GGC TTT GAG TAA TGA GAA TTT CGA; 5' ATC AAT TGC AAT CAA GAA GTG TTG; IL-15Rα, 5' GGC GAC GCG GGG CAT CAC; 5' TCG CTG TGG CCC TGT GGA TA.

7. Funktionstests von CD4+-Zellen, CD8+-Zellen und NK-Zellen

   1. Proliferationsassay Unter Verwendung des Einbaus von BrdU während der Zellproliferation wurde die Proliferationsfähigkeit von CD4+-Zellen, CD8+-Zellen und NK-Zellen bewertet, wenn unterschiedliche Konzentrationen von IL-15 und IL-2 hinzugefügt wurden.
   2. Sekretionsassay Die Konzentrationen von IFN-γ, IL-6 und IL-10 im Überstand wurden mithilfe von ELISA-Kits nachgewiesen, wenn dem Kulturmedium unterschiedliche Konzentrationen von IL-15 und IL-2 zugesetzt wurden.
   3. Fluoreszenzbasierte zelluläre Zytotoxizität – FCC-Assay Die NK- und CTL-vermittelte Zytolyse von Zielzellen stellt eine Form der Apoptose dar und geht mit vielen der gleichen Ereignisse einher, einschließlich der Caspase-Aktivierung. Wir haben das fluorogene Substrat für Caspase 6 in die Zielzellen (K562-Zellen und autologe Zytotrophoblasten) eingebaut und die Caspase-Aktivierung durch Nachweis der vom gespaltenen Substrat emittierten Fluoreszenz gemessen.

Die Expression von IL-15 und IL-15Rα im menschlichen Embryo vor und nach der Co-Kultivierung mit autologem Endometrium

1. Immunzytochemische Färbung eines menschlichen Embryos. Menschliche Embryonen aus einem IVF-Programm wurden mit eiskaltem Fixierungspuffer auf dem Adhäsionsobjektträger fixiert. Der Phycoerythrin-konjugierte monoklonale Anti-IL-15-Antikörper oder der biotinylierte Anti-Human-IL-15Rα-Antikörper und das Streptavidin-Fluoresceinisothiocyanat (SAv-FITC)-Konjugat wurden hinzugefügt. Das Fluoroskop wurde verwendet, um die von den Zielen emittierte Fluoreszenz zu erfassen.
2. Einzelzell-PCR von IL-15- und IL-15Rα-mRNA Unter Verwendung des Biotin/Streptavidin-„Capture“-Prinzips wurde die Embryo-mRNA mit dem Micro RNA Isolation Kit isoliert, mit Biotin-markierter Oligo-dT-Sonde markiert und mit Streptavidin beschichtet extrahiert Röhren. Nach der Transformation in cDNA wurde eine Echtzeit-PCR mit verschiedenen Sonden für ß-Actin, IL-15 und IL-15Rα mit dem ABI PRISM 7700 Sequence Detector System wie oben beschrieben durchgeführt.
3. Trennung autologer Endometriumzellen Eine Lutealphasen-Endometriumbiopsie wurde in einem Zyklus vor dem IVF-Eingriff der Patientin mit einer Endometrium-Saugkürette von Pipelle durchgeführt. Das Gewebe wurde mit 0,2 % Kollagenase Typ 2 verdaut und durch differenzielle Sedimentation bei Einheitsschwerkraft absetzen gelassen. Die obigen Schritte wurden viermal wiederholt und der Überstand wurde gesammelt. Nach der Differentialsedimentation bei Einheitsschwerkraft wurde der Überstand, der die mit Stroma angereicherte Fraktion enthielt, zur späteren Verwendung in Gewebekulturflaschen überführt. Die nach den vier Verdauungen verbleibenden Gewebestücke wurden in 10 ml HBSS resuspendiert. Nach etwa 30 Sekunden ließ man die oberen 8 ml bei Einheitsschwerkraft absetzen. Diese Sedimentation, die eine mit Drüsen angereicherte Fraktion enthielt, wurde in RPMI resuspendiert und zur zukünftigen Co-Kultur in Gewebekulturflaschen ausplattiert.
4. Autologe Endometrium-Kokultur eines menschlichen Embryos. Ungefähr eine gleiche Menge der Drüsen- und Stromazellen wurde am geschätzten Tag vor der Verabreichung von hCG während des IVF-Zyklus der Patientin gemischt. Etwa 3x10^5 Zellen wurden in eine Gewebekulturplatte mit vier Vertiefungen ausgesät und die Zygoten in das Co-Kultursystem oder herkömmliches Medium (menschliche Eileiterflüssigkeit plus 15 % mütterliches Serum) gegeben. Die Spaltungsraten und das morphologische Erscheinungsbild wurden täglich beurteilt. Die morphologisch besten Embryonen wurden unabhängig vom Kultursystem 72 Stunden nach der Entnahme wieder dem Patienten übertragen. Die Implantationsrate wurde als Anzahl der intrauterinen Säcke mit fetaler Herzaktivität pro Anzahl übertragener Embryonen definiert. Klinische Schwangerschaften umfassten nur solche Schwangerschaften, bei denen am Tag 49 ein fetaler Herzschlag im transvaginalen Ultraschall dokumentiert wurde.
5. Die Zytokinverteilung im Co-Kulturmedium. Die Zytokine, einschließlich Th1-Zytokine (IL-2 und IFN-γ), Th2-Zytokine (IL-4, IL-6 und IL-10) und IL-15, wurden durch ELISA-Technik im bestimmt Co-Kulturmedium vor und nach der Embryonenplattierung.
6. Immunzytochemische Färbung menschlicher Drüsen- und Stromazellen des Endometriums Die gereinigten Drüsen- und Stromazellen des Endometriums wurden zweimal mit kaltem Waschpuffer gewaschen, um die an den Zellen anhaftenden Zytokine zu entfernen. Diese Zellen wurden dann mit eiskaltem Fixierungspuffer auf dem Adhäsionsobjektträger fixiert. Der Phycoerythrin-konjugierte monoklonale Anti-IL-15-Antikörper oder der biotinylierte Anti-Human-IL-15Rα-Antikörper und das Streptavidin-Fluoresceinisothiocyanat (SAv-FITC)-Konjugat wurden hinzugefügt. Das Fluoroskop wurde verwendet, um die von den Zielen emittierte Fluoreszenz zu erfassen.
7. Echtzeit-PCR von IL-15- und IL-15Rα-mRNA aus menschlichen Drüsen- und Stromazellen des Endometriums. Die Gesamt-RNA in Drüsen- und Stromazellen des Endometriums wurde mit Trizol extrahiert und mit umgekehrter Transkription in cDNA transformiert. Die Echtzeit-PCR wurde mit verschiedenen Sonden für ß-Actin, IL-15 und IL-15Rα mit dem ABI PRISM 7700 Sequence Detector System wie oben beschrieben durchgeführt.