Uttrykket av IL-15 og dets reseptor i Decidua

Ekspresjonen av IL-15 og IL-15Ra i lymfocyttene i perifert blod og decidua under tidlig graviditet

1. Samling av prøver Samle inn det perifere blodet og decidualvevet fra 20-30 gravide kvinner i 6-8 ukers svangerskapsalder under D&C-prosedyren på grunn av multiparitet.
2. Immunhistokjemisk farging av decidualvev Den frosne delen av decidualvev ble utført i henhold til anbefalte prosedyrer. Første antistoff, muse-anti-humant IL-15 eller IL-15Ra monoklonalt antistoff, andre antistoff, peroksidase-merket geit-anti-mus polyklonalt antistoff og fargereagenser ble tilsatt sekvensielt. Til slutt ble objektglassene motfarget med hematoksylin.
3. Separasjon av mononukleære celler Decidualvev og perifere blodprøver ble tatt fra hver gravid kvinne ved aborttidspunktet. For å minimere kontaminering med blod, ble decidualvevet makroskopisk separert fra chorionvilli, vasket to ganger med Hanks balanserte saltløsning, kuttet i små biter, vasket to ganger igjen og ført gjennom en 1,9 mm maske for å fjerne gjenværende blod uten å enzymatisk behandling. Disse prøvene ble deretter filtrert gjennom et 45,7 μm rustfritt stålnett for å fjerne vevsrester. Den filtrerte løsningen ble lagt over en Ficoll-Paque PLUS-gradient og sentrifugert i 45 minutter ved 400 g. En anriket cellesuspensjon av mononukleære celler ble samlet ved grensesnittet og deretter vasket to ganger med RPMI-1640-medium. Perifere mononukleære blodceller ble også isolert ved Ficoll-Paque PLUS-sedimentering.
4. Cytometriske analyser Ekspresjonen av intracellulært IL-15 og overflate-IL-15Ra i mononukleære celler ble analysert med flowcytometri. Antistoffkombinasjonene inkluderte: FITC/PE/PerCP-CD4/IL-15/CD3, CD8/IL-15/CD3, CD56/IL-15/CD3, CD4/IL-15Ra/CD3, CD8/IL-15Ra/CD3 CD56/IL-15Ra/CD3.
5. Separasjon av CD4+-celler, CD8+-celler og NK-celler CD4+-cellene, CD8+-cellene og NK-cellene i henholdsvis perifert blod og deciduae ble separert med magnetisk aktivert cellesorterer (MACS).
6. Sanntids-PCR av IL-15 og IL-15Ra mRNA Totalt RNA i CD4+ celler, CD8+ celler og NK celler ble ekstrahert med Trizol, og ble transformert til cDNA med revers transkripsjon. Sanntids-PCR ble utført ved bruk av forskjellige prober for ß-aktin, IL-15 og IL-15Ra med ABI PRISM 7700 sekvensdetektorsystem. Primersekvensene var: ß-aktin, 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA; 5' CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC; IL-15, 5' GGC TTT GAG TAA TGA GAA TTT CGA; 5' ATC AAT TGC AAT CAA GAA GTG TTG; IL-15Ra, 5' GGC GAC GCG GGG CAT CAC; 5' TCG CTG TGG CCC TGT GGA TA.

7. Funksjonstester av CD4+-celler, CD8+-celler og NK-celler

   1. Proliferativ analyse Ved å bruke inkorporering av BrdU under cellulær proliferasjon, ble proliferasjonsevnen til CD4+-celler, CD8+-celler og NK-celler vurdert når forskjellige konsentrasjoner av IL-15 og IL-2 ble tilsatt.
   2. Sekresjonsanalyse Konsentrasjonene av IFN-y, IL-6 og IL-10 i supernatanten ble påvist ved bruk av ELISA-sett når forskjellige konsentrasjoner av IL-15 og IL-2 ble tilsatt i kulturmediet.
   3. Fluoresensbasert cellulær cytotoksisitet- FCC-analyse NK- og CTL-mediert cytolyse av målceller utgjør en form for apoptose, og er ledsaget av mange av de samme hendelsene, inkludert kaspaseaktivering. Vi inkorporerte det fluorogene substratet for caspase 6 i målcellene (K562-celler og autologe cytotrofoblaster) og målte caspase-aktiveringen ved å detektere fluorescensen som sendes ut fra det spaltede substratet.

Ekspresjonen av IL-15 og IL-15Ra i det menneskelige embryoet før og etter samdyrket med autologt endometrium

1. Immuncytokjemisk farging av humant embryo Humane embryoer fra IVF-programmet ble fiksert på adhesjonsglasset med iskald fikseringsbuffer. Det phycoerythrin-konjugerte anti-IL-15 monoklonale antistoffet eller biotinylert anti-humant IL-15Ra antistoff og streptavidin-fluorescein isothiocyanat (SAv-FITC) konjugat ble tilsatt. Fluoroskopet ble brukt til å oppdage fluorescensen som ble sendt ut fra målene.
2. Enkeltcelle PCR av IL-15 og IL-15Ra mRNA Ved å bruke prinsippet om biotin/streptavidin "fangst", ble embryo-mRNA isolert med Micro RNA Isolation Kit, merket med biotin-merket oligo dT-probe og ekstrahert med streptavidin-belagt rør. Etter transformasjon til cDNA ble sanntids-PCR utført ved bruk av forskjellige prober for ß-aktin, IL-15 og IL-15Ra med ABI PRISM 7700 Sequence Detector System, som beskrevet ovenfor.
3. Separasjon av autologe endometrieceller En lutealfase endometriebiopsi ble utført i en syklus før pasientens IVF-prosedyre med en Pipelle Endometrial Suction Curette. Vevet ble fordøyd med 0,2 % kollagenase type 2 og fikk sedimentere ved differensiell sedimentering ved enhetstyngdekraft. Trinnene ovenfor ble gjentatt fire ganger og supernatanten ble samlet. Etter differensiell sedimentering ved enhetstyngdekraft ble supernatanten, inneholdende den stroma-anrikede fraksjonen, overført til vevskulturkolber for fremtidig bruk. Vevsstykkene, som ble igjen etter de fire fordøyelsene, ble resuspendert i 10 ml HBSS. Etter ca. 30 sekunder fikk de øverste 8 ml sette seg ved enhetstyngdekraft. Denne sedimentasjonen, som inneholder kjertelanriket fraksjon, ble resuspendert i RPMI og sådd ut i vevskulturkolber for fremtidig samkultur.
4. Autolog endometrial ko-kultur av humant embryo. Omtrent en lik mengde av kjertel- og stromalcellene ble blandet på den estimerte dagen før administrering av hCG under pasientens IVF-syklus. Omtrent 3x10^5 celler ble sådd inn i en fire-brønns vevskulturplate og zygotene ble plassert i samkultursystemet eller konvensjonelt medium (human tubal væske pluss 15% morserum). Spaltningshastigheter og morfologisk utseende ble vurdert daglig. De morfologisk beste embryoene ble overført tilbake til pasienten 72 timer etter uthenting uavhengig av kultursystem. Implantasjonshastigheten ble definert som antall intrauterine poser med føtal hjerteaktivitet per antall overførte embryoer. Kliniske svangerskap inkluderte bare de svangerskapene med føtalt hjerteslag dokumentert på transvaginal ultralyd på dag 49.
5. Cytokinfordelingen i samkulturmedium Cytokinene, inkludert Th1-cytokiner (IL-2 og IFN-y), Th2-cytokiner (IL-4, IL-6 og IL-10) og IL-15 ble bestemt ved ELISA-teknikk i co-kultur medium før og etter embryoer utplatet.
6. Immunocytokjemisk farging av humane endometriekjertel- og stromaceller. De rensede endometriekjertel- og stromacellene ble vasket to ganger med kald vaskebuffer for å fjerne cytokinene som festet seg på cellene. Disse cellene ble deretter festet på adhesjonsglasset med iskald fikseringsbuffer. Det phyco-erythrin-konjugerte anti-IL-15 monoklonale antistoffet eller biotinylert anti-humant IL-15Ra antistoff og streptavidin-fluorescein isothiocyanat (SAv-FITC) konjugat ble tilsatt. Fluoroskopet ble brukt til å oppdage fluorescensen som ble sendt ut fra målene.
7. Sanntids-PCR av IL-15 og IL-15Ra mRNA fra humane endometriale kjertel- og stromaceller. Det totale RNA i endometriekjertel- og stromaceller ble ekstrahert med Trizol og transformert til cDNA med revers transkripsjon. Sanntids-PCR ble utført ved bruk av forskjellige prober for ß-aktin, IL-15 og IL-15Ra med ABI PRISM 7700 sekvensdetektorsystem, som beskrevet ovenfor.