Ekspressionen af ​​IL-15 og dens receptor i Decidua

Ekspressionen af ​​IL-15 og IL-15Ra i lymfocytterne i perifert blod og decidua under tidlig graviditet

1. Indsamling af prøver Saml det perifere blod og decidualvæv fra 20-30 gravide kvinder i 6-8 ugers svangerskabsalder under D&C-proceduren på grund af multiparitet.
2. Immunhistokemisk farvning af decidualvæv Den frosne del af decidualvæv blev udført i overensstemmelse med anbefalede procedurer. Første antistof, muse-anti-humant IL-15 eller IL-15Ra monoklonalt antistof, andet antistof, peroxidase-mærket gede-anti-mus polyklonalt antistof og farvereagenser blev tilsat sekventielt. Til sidst blev objektglassene modfarvet med hæmatoxylin.
3. Adskillelse af mononukleære celler Decidualvævs- og perifere blodprøver blev taget fra hver gravid kvinde på tidspunktet for aborten. For at minimere kontaminering med blod blev det decidale væv makroskopisk adskilt fra chorionvilli, vasket to gange med Hanks balancerede saltopløsning, skåret i små stykker, vasket to gange igen og ført gennem en 1,9 mm maske for at fjerne det resterende blod uden at enzymatisk behandling. Disse prøver blev derefter filtreret gennem et 45,7 μm rustfrit stålnet for at fjerne vævsrester. Den filtrerede opløsning blev lagt over en Ficoll-Paque PLUS-gradient og centrifugeret i 45 minutter ved 400 g. En beriget cellesuspension af mononukleære celler blev opsamlet ved grænsefladen og derefter vasket to gange med RPMI-1640-medium. Mononukleære celler fra perifert blod blev også isoleret ved Ficoll-Paque PLUS sedimentering.
4. Cytometriske analyser Ekspressionen af ​​intracellulært IL-15 og overflade-IL-15Ra i mononukleære celler blev analyseret med flowcytometri. Antistofkombinationerne inkluderede: FITC/PE/PerCP-CD4/IL-15/CD3, CD8/IL-15/CD3, CD56/IL-15/CD3, CD4/IL-15Ra/CD3, CD8/IL-15Ra/CD3 CD56/IL-15Ra/CD3.
5. Separation af CD4+-celler, CD8+-celler og NK-celler CD4+-cellerne, CD8+-cellerne og NK-cellerne i henholdsvis perifert blod og deciduae blev separeret med magnetisk aktiveret cellesortering (MACS).
6. Real-time PCR af IL-15 og IL-15Ra mRNA Det totale RNA i CD4+ celler, CD8+ celler og NK celler blev ekstraheret med Trizol og blev transformeret til cDNA med revers transkription. Realtids-PCR blev udført under anvendelse af forskellige prober for ß-actin, IL-15 og IL-15Ra med ABI PRISM 7700 sekvensdetektorsystem. Primersekvenserne var: ß-actin, 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA; 5' CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC; IL-15, 5' GGC TTT GAG TAA TGA GAA TTT CGA; 5' ATC AAT TGC AAT CAA GAA GTG TTG; IL-15Ra, 5' GGC GAC GCG GGG CAT CAC; 5' TCG CTG TGG CCC TGT GGA TA.

7. Funktionstest af CD4+-celler, CD8+-celler og NK-celler

   1. Proliferativ assay Under anvendelse af inkorporering af BrdU under cellulær proliferation blev den proliferative evne af CD4+-celler, CD8+-celler og NK-celler vurderet, når forskellige koncentrationer af IL-15 og IL-2 blev tilsat.
   2. Sekretionsassay Koncentrationerne af IFN-y, IL-6 og IL-10 i supernatanten blev påvist under anvendelse af ELISA-kits, når forskellige koncentrationer af IL-15 og IL-2 blev tilsat til dyrkningsmediet.
   3. Fluoresensbaseret cellulær cytotoksicitet- FCC-assay NK- og CTL-medieret cytolyse af målceller udgør en form for apoptose og er ledsaget af mange af de samme hændelser, herunder caspaseaktivering. Vi inkorporerede det fluorogene substrat for caspase 6 i målcellerne (K562-celler og autologe cytotrofoblaster) og målte caspaseaktiveringen ved at detektere fluorescensen udsendt fra det spaltede substrat.

Ekspressionen af ​​IL-15 og IL-15Ra i det humane embryo før og efter samdyrkning med autologt endometrium

1. Immunocytokemisk farvning af humant embryo Humane embryoner fra IVF-programmet blev fikseret på adhæsionsglasset med iskold fikseringsbuffer. Det phycoerythrin-konjugerede anti-IL-15 monoklonale antistof eller biotinylerede anti-humant IL-15Ra antistof og streptavidin-fluorescein isothiocyanat (SAv-FITC) konjugat blev tilføjet. Fluoroskopet blev brugt til at detektere fluorescensen udsendt fra målene.
2. Enkeltcellet PCR af IL-15 og IL-15Ra mRNA Ved at bruge princippet om biotin/streptavidin "fangst" blev embryo-mRNA'et isoleret med Micro RNA Isolation Kit, mærket med biotin-mærket oligo dT-probe og ekstraheret med streptavidin-coatet rør. Efter transformation til cDNA blev real-time PCR udført under anvendelse af forskellige prober for ß-actin, IL-15 og IL-15Ra med ABI PRISM 7700 Sequence Detector System, som beskrevet ovenfor.
3. Adskillelse af autologe endometrieceller En lutealfase endometriebiopsi blev udført i en cyklus før patientens IVF-procedure med en Pipelle Endometrial Suction Curette. Vævet blev fordøjet med 0,2% collagenase type 2 og fik lov til at bundfælde sig ved differentiel sedimentation ved enhedsvægt. Ovenstående trin blev gentaget fire gange, og supernatanten blev opsamlet. Efter differentiel sedimentering ved enhedstyngdekraft blev supernatanten, der indeholdt den stromaberigede fraktion, overført til vævskulturkolber til fremtidig brug. Vævsstykkerne, som var tilbage efter de fire fordøjelser, blev resuspenderet i 10 ml HBSS. Efter ca. 30 sekunder fik de øverste 8 ml lov til at bundfælde sig ved enhedsvægt. Denne sedimentation, der indeholdt kirtelberiget fraktion, blev resuspenderet i RPMI og udpladet i vævskulturkolber til fremtidig co-kultur.
4. Autolog endometrial co-kultur af humant embryo. Omtrent en lige stor mængde af kirtel- og stromacellerne blev blandet på den estimerede dag før administrationen af ​​hCG under patientens IVF-cyklus. Ca. 3 x 10^5 celler blev podet i en vævskulturplade med fire brønde, og zygoterne blev anbragt i co-kultursystemet eller det konventionelle medium (human tubal væske plus 15% maternalt serum). Spaltningshastigheder og morfologisk udseende blev vurderet dagligt. De morfologisk bedste embryoner blev overført tilbage til patienten 72 timer efter udtagning, uanset dyrkningssystem. Implantationshastigheden blev defineret som antallet af intrauterine poser med føtal hjerteaktivitet pr. antal overførte embryoner. Kliniske graviditeter inkluderede kun de graviditeter med et føtalt hjerteslag dokumenteret på transvaginal ultralyd på dag 49.
5. Cytokinfordelingen i co-kulturmedium Cytokinerne, inklusive Th1-cytokiner (IL-2 og IFN-y), Th2-cytokiner (IL-4, IL-6 og IL-10) og IL-15 blev bestemt ved ELISA-teknik i co-kulturmedium før og efter embryoner udpladet.
6. Immunocytokemisk farvning af humane endometriekirtel- og stromaceller De oprensede endometriekirtel- og stromaceller blev vasket to gange med kold vaskebuffer for at fjerne de cytokiner, der klæber til cellerne. Disse celler blev derefter fikseret på adhæsionsglasset med iskold fikseringsbuffer. Det phycoerythrin-konjugerede anti-IL-15 monoklonale antistof eller biotinylerede anti-humant IL-15Ra antistof og streptavidin-fluorescein isothiocyanat (SAv-FITC) konjugat blev tilføjet. Fluoroskopet blev brugt til at detektere fluorescensen udsendt fra målene.
7. Realtids-PCR af IL-15 og IL-15Ra mRNA fra humane endometriekirtel- og stromaceller. Det totale RNA i endometriekirtel- og stromaceller blev ekstraheret med Trizol og transformeret til cDNA med revers transkription. Real-time PCR blev udført under anvendelse af forskellige prober for ß-actin, IL-15 og IL-15Ra med ABI PRISM 7700 Sequence Detector System, som beskrevet ovenfor.