Az IL-15 és receptorának kifejeződése Deciduában

Az IL-15 és IL-15Rα expressziója a perifériás vér és decidua limfocitáiban a terhesség korai szakaszában

1. Mintagyűjtés 20-30, 6-8 hetes terhességi korú terhes nő perifériás vérét és deciduális szövetét gyűjtsük össze a D&C eljárás során a multiparitás miatt.
2. A deciduális szövet immunhisztokémiai festése A deciduális szövet fagyasztott metszetét az ajánlott eljárások szerint végeztük. Az első antitestet, az egér anti-humán IL-15 vagy IL-15Ra monoklonális antitestet, a második antitestet, a peroxidázzal jelölt kecske anti-egér poliklonális antitestet és a színező reagenseket egymás után adtuk hozzá. Végül a lemezeket hematoxilinnel ellenfestettük.
3. A mononukleáris sejtek szétválasztása minden terhes nőtől az abortusz idején deciduális szövetet és perifériás vérmintát vettünk. A vérrel való szennyeződés minimalizálása érdekében a deciduális szövetet makroszkóposan elválasztottuk a chorionbolyhoktól, kétszer mostuk Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldattal, apró darabokra vágtuk, kétszer mostuk újra, majd egy 1,9 mm-es hálón keresztül eltávolítottuk a visszamaradt vért. enzimes kezelés. Ezeket a mintákat ezután 45,7 μm-es rozsdamentes acél hálón átszűrtük, hogy eltávolítsuk a szövettörmeléket. A szűrt oldatot Ficoll-Paque PLUS gradiensre rétegeztük, és 45 percig 400 g-vel centrifugáltuk. A mononukleáris sejtek dúsított sejtszuszpenzióját összegyűjtöttük a határfelületen, majd kétszer mostuk RPMI-1640 tápközeggel. A perifériás vér mononukleáris sejtjeit Ficoll-Paque PLUS szedimentációval is izoláltuk.
4. Citometriás elemzések Az intracelluláris IL-15 és a felszíni IL-15Rα expresszióját mononukleáris sejtekben áramlási citometriával elemeztük. Az antitest-kombinációk a következők voltak: FITC/PE/PerCP-CD4/IL-15/CD3, CD8/IL-15/CD3, CD56/IL-15/CD3, CD4/IL-15Rα/CD3, CD8/IL-15Rα/CD3 , CD56/IL-15Ra/CD3.
5. CD4+ sejtek, CD8+ sejtek és NK sejtek szétválasztása A CD4+ sejteket, a CD8+ sejteket és az NK sejteket a perifériás vérben és a deciduae sejteket mágnesesen aktivált sejtválogatóval (MACS) választottuk el.
6. IL-15 és IL-15Rα mRNS valós idejű PCR-je A CD4+ sejtekben, CD8+ sejtekben és NK sejtekben lévő teljes RNS-t Trizollal extraháltuk, majd reverz transzkripcióval cDNS-be transzformáltuk. A valós idejű PCR-t különböző ß-aktin, IL-15 és IL-15Rα próbákkal végeztük ABI PRISM 7700 Sequence Detector System segítségével. A primer szekvenciák a következők voltak: ß-aktin, 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA; 5' CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC; IL-15, 5' GGC TTT GAG TAA TGA GAA TTT CGA; 5' ATC AAT TGC AAT CAA GAA GTG TTG; IL-15Ra, 5' GGC GAC GCG GGG CAT CAC; 5' TCG CTG TGG CCC TGT GGA TA.

7. CD4+ sejtek, CD8+ sejtek és NK sejtek funkcionális tesztjei

   1. Proliferációs vizsgálat A BrdU sejtproliferáció során történő beépülését felhasználva a CD4+ sejtek, CD8+ sejtek és NK sejtek proliferációs képességét értékeltük, amikor különböző koncentrációjú IL-15 és IL-2 adtuk hozzá.
   2. Szekréciós vizsgálat Az IFN-γ, IL-6 és IL-10 koncentrációját a felülúszóban ELISA kitekkel detektáltuk, amikor különböző koncentrációjú IL-15-öt és IL-2-t adtunk a táptalajhoz.
   3. Fluoreszcencia alapú sejtes citotoxicitás – FCC vizsgálat A célsejtek NK- és CTL-mediált citolízise az apoptózis egyik formája, és sok hasonló esemény kíséri, beleértve a kaszpázaktivációt. A kaszpáz 6 fluorogén szubsztrátját beépítettük a célsejtekbe (K562 sejtek és autológ citotrofoblasztok), és mértük a kaszpáz aktivációt a hasított szubsztrátból kibocsátott fluoreszcencia detektálásával.

Az IL-15 és IL-15Rα expressziója az emberi embrióban autológ endometriummal való együtttenyésztés előtt és után

1. Humán embrió immuncitokémiai festése Az IVF programból származó emberi embriókat jéghideg fixáló pufferrel rögzítettük az adhéziós tárgylemezre. Hozzáadtuk a fikoeritrinnel konjugált anti-IL-15 monoklonális antitestet vagy biotinilált anti-humán IL-15Ra antitestet és a sztreptavidin-fluoreszcein-izotiocianát (SAv-FITC) konjugátumot. A fluoroszkóppal a célpontok által kibocsátott fluoreszcenciát detektáltuk.
2. IL-15 és IL-15Rα mRNS egysejtű PCR-reakciója A biotin/sztreptavidin „befogás” elvét alkalmazva az embrió mRNS-t Micro RNA Isolation Kit segítségével izoláltuk, biotinnal jelölt oligo dT-próbával jelöltük, és sztreptavidinnel bevont anyaggal extraháltuk. csövek. A cDNS-be való transzformáció után valós idejű PCR-t hajtottunk végre a ß-aktin, IL-15 és IL-15Ra különböző próbáival, ABI PRISM 7700 Sequence Detector System rendszerrel, a fent leírtak szerint.
3. Autológ endometrium sejtek elválasztása Luteális fázisú méhnyálkahártya biopsziát végeztünk egy ciklusban a páciens IVF eljárása előtt Pipelle Endometrium Suction Curette segítségével. A szövetet 0,2%-os 2-es típusú kollagenázzal emésztettük, és egységnyi gravitáció mellett differenciális ülepedéssel hagytuk leülepedni. A fenti lépéseket négyszer megismételtük, és a felülúszót összegyűjtöttük. Az egységnyi gravitáció melletti differenciális ülepítés után a stromában dúsított frakciót tartalmazó felülúszót szövettenyésztő lombikba vittük át későbbi felhasználásra. A négy emésztés után megmaradt szövetdarabokat 10 ml HBSS-ben szuszpendáltuk. Körülbelül 30 másodperc elteltével a felső 8 ml-t hagytuk leülepedni egységnyi gravitáció mellett. Ezt a mirigyben dúsított frakciót tartalmazó ülepedést RPMI-ben újraszuszpendáltuk, és szövettenyésztő lombikokba szélesztettük a jövőbeli együtttenyésztéshez.
4. Humán embrió autológ endometrium társtenyésztése Körülbelül azonos mennyiségű mirigy- és stromasejteket kevertek össze a hCG beadása előtti napon a páciens IVF-ciklusa során. Körülbelül 3x10^5 sejtet oltottunk be egy négylyukú szövettenyésztő lemezre, és a zigótákat az együtttenyésztő rendszerbe vagy a hagyományos táptalajba (humán petevezetékfolyadék plusz 15% anyai szérum) helyeztük. A hasítási sebességet és a morfológiai megjelenést naponta értékeltük. A morfológiailag legjobb embriókat a tenyésztési rendszertől függetlenül 72 órával a kinyerést követően visszavittük a páciensbe. A beültetési sebességet a magzati szívaktivitást mutató méhen belüli tasakok számaként határozták meg az átvitt embriók számára vonatkoztatva. A klinikai terhességek között csak azok a terhességek szerepeltek, amelyeknél a magzati szívverést a 49. napon transzvaginális ultrahanggal dokumentálták.
5. A citokinek megoszlása ​​a ko-tenyésztő tápközegben A citokineket, köztük a Th1 citokineket (IL-2 és IFN-γ), a Th2 citokineket (IL-4, IL-6 és IL-10) és az IL-15-öt ELISA technikával határoztuk meg a kotenyésztési táptalaj a lemezelt embriók előtt és után.
6. Humán endometrium mirigy- és stromasejtek immuncitokémiai festése A tisztított endometrium mirigy- és stromasejteket kétszer mostuk hideg mosópufferrel, hogy eltávolítsuk a sejtekre tapadt citokineket. Ezeket a sejteket ezután jéghideg fixáló pufferrel rögzítettük az adhéziós tárgylemezen. Hozzáadtuk a fikoeritrinnel konjugált anti-IL-15 monoklonális antitestet vagy biotinilált anti-humán IL-15Ra antitestet és a sztreptavidin-fluoreszcein-izotiocianát (SAv-FITC) konjugátumot. A fluoroszkóppal a célpontok által kibocsátott fluoreszcenciát detektáltuk.
7. IL-15 és IL-15Rα mRNS valós idejű PCR-vizsgálata humán endometrium mirigy- és stromasejtekből Az endometrium mirigy- és stromasejtek teljes RNS-ét Trizollal extraháltuk, és reverz transzkripcióval cDNS-vé transzformáltuk. A valós idejű PCR-t különböző ß-aktin, IL-15 és IL-15Rα próbákkal végeztük ABI PRISM 7700 Sequence Detector System rendszerrel, a fent leírtak szerint.