A expressão de IL-15 e seu receptor na decídua

A expressão de IL-15 e IL-15Rα nos linfócitos do sangue periférico e da decídua durante o início da gravidez

1. Coleta de amostras Colete sangue periférico e tecido decidual de 20 a 30 mulheres grávidas de 6 a 8 semanas de idade gestacional durante procedimento de D&C devido à multiparidade.
2. Coloração imuno-histoquímica de tecido decidual A seção congelada de tecido decidual foi realizada de acordo com os procedimentos recomendados. Primeiro anticorpo, anticorpo monoclonal de camundongo anti-IL-15 ou IL-15Rα humana, segundo anticorpo, anticorpo policlonal de cabra anti-camundongo marcado com peroxidase e reagentes coloridos foram adicionados sequencialmente. Por fim, as lâminas foram contracoradas com hematoxilina.
3. Separação de células mononucleares Amostras de tecido decidual e sangue periférico foram coletadas de cada gestante no momento do aborto. Para minimizar a contaminação por sangue, o tecido decidual foi macroscopicamente separado das vilosidades coriônicas, lavado duas vezes com solução salina balanceada de Hank, cortado em pequenos pedaços, lavado duas vezes novamente e passado por uma malha de 1,9 mm para remover o sangue residual sem tratamento enzimático. Essas amostras foram então filtradas através de uma malha de aço inoxidável de 45,7 μm para remover os restos de tecido. A solução filtrada foi colocada sobre um gradiente Ficoll-Paque PLUS e centrifugada por 45 minutos a 400g. Uma suspensão enriquecida de células mononucleares foi coletada na interface e então lavada duas vezes com meio RPMI-1640. Células mononucleares de sangue periférico também foram isoladas por sedimentação Ficoll-Paque PLUS.
4. Análises citométricas A expressão de IL-15 intracelular e IL-15Rα de superfície em células mononucleares foi analisada por citometria de fluxo. As combinações de anticorpos incluíram: FITC/PE/PerCP- CD4/IL-15/CD3, CD8/IL-15/CD3, CD56/IL-15/CD3, CD4/IL-15Rα/CD3, CD8/IL-15Rα/CD3 , CD56/IL-15Ra/CD3.
5. Separação de células CD4+, células CD8+ e células NK As células CD4+, células CD8+ e células NK no sangue periférico e decídua foram separadas, respectivamente, com classificador de células ativado por magnetismo (MACS).
6. PCR em tempo real de mRNA de IL-15 e IL-15Rα O RNA total em células CD4+, CD8+ e células NK foi extraído com Trizol e transformado em cDNA com transcrição reversa. A PCR em tempo real foi realizada usando diferentes sondas para ß-actina, IL-15 e IL-15Rα com ABI PRISM 7700 Sequence Detector System. As sequências dos primers foram: ß-actina, 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA; 5' CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC; IL-15, 5' GGC TTT GAG TAA TGA GAA TTT CGA; 5' ATC AAT TGC AAT CAA GAA GTG TTG; IL-15Rα, 5' GGC GAC GCG GGG CAT CAC; 5' TCG CTG TGG CCC TGT GGA TA.

7. Testes funcionais de células CD4+, células CD8+ e células NK

   1. Ensaio proliferativo Usando a incorporação de BrdU durante a proliferação celular, a capacidade proliferativa de células CD4+, células CD8+ e células NK foi avaliada quando diferentes concentrações de IL-15 e IL-2 foram adicionadas.
   2. Ensaio de secreção As concentrações de IFN-γ, IL-6 e IL-10 no sobrenadante foram detectadas usando kits ELISA quando diferentes concentrações de IL-15 e IL-2 foram adicionadas ao meio de cultura.
   3. Citotoxicidade celular baseada em fluorescência - ensaio FCC A citólise mediada por NK e CTL de células-alvo constitui uma forma de apoptose e é acompanhada por muitos dos mesmos eventos, incluindo a ativação de caspases. Incorporamos o substrato fluorogênico para a caspase 6 nas células-alvo (células K562 e citotrofoblastos autólogos) e medimos a ativação da caspase detectando a fluorescência emitida pelo substrato clivado.

A expressão de IL-15 e IL-15Rα no embrião humano antes e depois do co-cultivo com endométrio autólogo

1. Coloração imunocitoquímica de embriões humanos Os embriões humanos do programa de fertilização in vitro foram fixados na lâmina de adesão com Fixation Buffer gelado. O anticorpo monoclonal anti-IL-15 conjugado com ficoeritrina ou o anticorpo anti-IL-15Rα humano biotinilado e o conjugado isotiocianato de estreptavidina-fluoresceína (SAv-FITC) foram adicionados. O fluoroscópio foi usado para detectar a fluorescência emitida pelos alvos.
2. PCR de célula única de IL-15 e IL-15Rα mRNA Usando o princípio de "captura" de biotina/estreptavidina, o mRNA do embrião foi isolado com Micro RNA Isolation Kit, marcado com sonda oligo dT marcada com biotina e extraído com estreptavidina revestida tubos. Após a transformação para cDNA, a PCR em tempo real foi realizada usando diferentes sondas para ß-actina, IL-15 e IL-15Rα com ABI PRISM 7700 Sequence Detector System, conforme descrito acima.
3. Separação de células endometriais autólogas Uma biópsia endometrial de fase lútea foi realizada em um ciclo antes do procedimento de fertilização in vitro da paciente com uma cureta de sucção endometrial Pipelle. O tecido foi digerido com colagenase tipo 2 a 0,2% e deixado sedimentar por sedimentação diferencial em gravidade unitária. As etapas acima foram repetidas quatro vezes e o sobrenadante foi coletado. Após sedimentação diferencial em gravidade unitária, o sobrenadante, contendo a fração enriquecida com estroma, foi transferido para frascos de cultura de tecidos para uso futuro. Os pedaços de tecido, que permaneceram após as quatro digestões, foram ressuspensos em 10 mL de HBSS. Após aproximadamente 30 segundos, os 8 mL superiores foram deixados assentar em gravidade unitária. Essa sedimentação, contendo fração enriquecida com glândulas, foi ressuspensa em RPMI e semeada em frascos de cultura de tecidos para futura co-cultura.
4. Co-cultura endometrial autóloga de embrião humano Aproximadamente uma quantidade igual de células glandulares e estromais foram misturadas no dia estimado antes da administração de hCG durante o ciclo de FIV da paciente. Cerca de 3x10^5 células foram semeadas em uma placa de cultura de tecidos de quatro poços e os zigotos foram colocados no sistema de co-cultura ou meio convencional (fluido tubário humano mais 15% de soro materno). As taxas de clivagem e aparência morfológica foram avaliadas diariamente. Os embriões morfologicamente melhores foram transferidos de volta para o paciente 72 horas após a recuperação, independentemente do sistema de cultura. A taxa de implantação foi definida como o número de sacos intrauterinos com atividade cardíaca fetal por número de embriões transferidos. As gestações clínicas incluíram apenas as gestações com batimentos cardíacos fetais documentados na ultrassonografia transvaginal no dia 49.
5. A distribuição de citocinas em meio de co-cultura As citocinas, incluindo citocinas Th1 (IL-2 e IFN-γ), citocinas Th2 (IL-4, IL-6 e IL-10) e IL-15 foram determinadas pela técnica de ELISA no meio de co-cultura antes e depois dos embriões semeados.
6. Coloração imunocitoquímica de células endometriais glandulares e estromais humanas As células glandulares e estromais endometriais purificadas foram lavadas duas vezes com Tampão de Lavagem frio para remover as citocinas aderidas às células. Essas células foram então fixadas na lâmina de adesão com Tampão de Fixação gelado. O anticorpo monoclonal anti-IL-15 conjugado com ficoeritrina ou o anticorpo anti-IL-15Rα humano biotinilado e o conjugado isotiocianato de estreptavidina-fluoresceína (SAv-FITC) foram adicionados. O fluoroscópio foi usado para detectar a fluorescência emitida pelos alvos.
7. PCR em tempo real de mRNA de IL-15 e IL-15Rα de células endometriais e estromais humanas O RNA total em células endometriais glandulares e estromais foi extraído com Trizol e transformado em cDNA com transcrição reversa. A PCR em tempo real foi realizada usando diferentes sondas para ß-actina, IL-15 e IL-15Rα com ABI PRISM 7700 Sequence Detector System, conforme descrito acima.