L'espressione di IL-15 e il suo recettore in Decidua

L'espressione di IL-15 e IL-15Rα nei linfociti del sangue periferico e della decidua durante l'inizio della gravidanza

1. Raccolta dei campioni Raccogliere il sangue periferico e il tessuto deciduale da 20-30 donne in gravidanza di età gestazionale di 6-8 settimane durante la procedura D&C a causa della multiparità.
2. Colorazione immunoistochimica del tessuto deciduale La sezione congelata del tessuto deciduale è stata eseguita secondo le procedure raccomandate. Primo anticorpo, anticorpo monoclonale IL-15 o IL-15Rα umano anti-topo, secondo anticorpo, anticorpo policlonale anti-topo di capra marcato con perossidasi e reagenti colorati sono stati aggiunti in sequenza. Infine i vetrini sono stati controcolorati con ematossilina.
3. Separazione delle cellule mononucleari Da ciascuna donna incinta al momento dell'aborto sono stati prelevati campioni di tessuto deciduale e di sangue periferico. Per ridurre al minimo la contaminazione da parte del sangue, il tessuto deciduale è stato separato macroscopicamente dai villi coriali, lavato due volte con soluzione salina bilanciata di Hank, tagliato in piccoli pezzi, lavato ancora due volte e passato attraverso una rete da 1,9 mm per rimuovere il sangue residuo senza trattamento enzimatico. Questi campioni sono stati quindi filtrati attraverso una rete di acciaio inossidabile da 45,7 μm per rimuovere i detriti di tessuto. La soluzione filtrata è stata stratificata su un gradiente Ficoll-Paque PLUS e centrifugata per 45 minuti a 400 g. Una sospensione cellulare arricchita di cellule mononucleate è stata raccolta all'interfaccia e quindi lavata due volte con terreno RPMI-1640. Anche le cellule mononucleari del sangue periferico sono state isolate mediante sedimentazione Ficoll-Paque PLUS.
4. Analisi citometriche L'espressione di IL-15 intracellulare e IL-15Rα di superficie in cellule mononucleate è stata analizzata con citometria a flusso. Le combinazioni di anticorpi includevano: FITC/PE/PerCP- CD4/IL-15/CD3, CD8/IL-15/CD3, CD56/IL-15/CD3, CD4/IL-15Rα/CD3, CD8/IL-15Rα/CD3 , CD56/IL-15Rα/CD3.
5. Separazione di cellule CD4+, CD8+ e NK Le cellule CD4+, CD8+ e NK nel sangue periferico e nelle decidue sono state separate rispettivamente con un selezionatore di cellule magnetiche attivate (MACS).
6. PCR in tempo reale dell'mRNA di IL-15 e IL-15Rα L'RNA totale nelle cellule CD4+, CD8+ e NK è stato estratto con Trizol ed è stato trasformato in cDNA con trascrizione inversa. La PCR in tempo reale è stata eseguita utilizzando diverse sonde per ß-actina, IL-15 e IL-15Rα con ABI PRISM 7700 Sequence Detector System. Le sequenze dei primer erano: ß-actina, 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA; 5' CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC; IL-15, 5' GGC TTT GAG TAA TGA GAA TTT CGA; 5' ATC AAT TGC AAT CAA GAA GTG TTG; IL-15Rα, 5' GGC GAC GCG GGG CAT CAC; 5' TCG CTG TGG CCC TGT GGA TA.

7. Test funzionali di cellule CD4+, cellule CD8+ e cellule NK

   1. Saggio proliferativo Utilizzando l'incorporazione di BrdU durante la proliferazione cellulare, è stata valutata la capacità proliferativa delle cellule CD4+, delle cellule CD8+ e delle cellule NK quando sono state aggiunte diverse concentrazioni di IL-15 e IL-2.
   2. Analisi della secrezione Le concentrazioni di IFN-γ, IL-6 e IL-10 nel surnatante sono state rilevate utilizzando i kit ELISA quando diverse concentrazioni di IL-15 e IL-2 sono state aggiunte nel terreno di coltura.
   3. Citotossicità cellulare basata sulla fluorescenza - Saggio FCC La citolisi mediata da NK e CTL delle cellule bersaglio costituisce una forma di apoptosi ed è accompagnata da molti degli stessi eventi, inclusa l'attivazione della caspasi. Abbiamo incorporato il substrato fluorogenico per la caspasi 6 nelle cellule bersaglio (cellule K562 e citotrofoblasti autologhi) e misurato l'attivazione della caspasi rilevando la fluorescenza emessa dal substrato scisso.

L'espressione di IL-15 e IL-15Rα nell'embrione umano prima e dopo la co-coltura con endometrio autologo

1. Colorazione immunocitochimica dell'embrione umano Gli embrioni umani del programma di fecondazione in vitro sono stati fissati sul vetrino adesivo con tampone di fissazione ghiacciato. Sono stati aggiunti l'anticorpo monoclonale anti-IL-15 coniugato con ficoeritrina o l'anticorpo anti-IL-15Rα umano biotinilato e il coniugato streptavidina-isotiocianato di fluoresceina (SAv-FITC). Il fluoroscopio è stato utilizzato per rilevare la fluorescenza emessa dai bersagli.
2. PCR a cellula singola dell'mRNA di IL-15 e IL-15Rα Usando il principio della "cattura" di biotina/streptavidina, l'mRNA dell'embrione è stato isolato con il kit di isolamento del micro RNA, etichettato con una sonda oligo dT marcata con biotina ed estratto con una sonda rivestita di streptavidina tubi. Dopo la trasformazione in cDNA, la PCR in tempo reale è stata eseguita utilizzando diverse sonde per ß-actina, IL-15 e IL-15Rα con il sistema ABI PRISM 7700 Sequence Detector System, come descritto sopra.
3. Separazione delle cellule endometriali autologhe Una biopsia endometriale in fase luteale è stata eseguita in un ciclo prima della procedura di fecondazione in vitro della paziente con una curetta di aspirazione endometriale Pipelle. Il tessuto è stato digerito con collagenasi di tipo 2 allo 0,2% e lasciato sedimentare mediante sedimentazione differenziale a gravità unitaria. I passaggi precedenti sono stati ripetuti quattro volte e il supernatante è stato raccolto. Dopo la sedimentazione differenziale a gravità unitaria, il supernatante, contenente la frazione arricchita di stroma, è stato trasferito in fiasche di coltura tissutale per un uso futuro. I pezzi di tessuto, rimasti dopo i quattro digerimenti, sono stati risospesi in 10 mL di HBSS. Dopo circa 30 secondi, gli 8 mL superiori sono stati lasciati stabilizzare a gravità unitaria. Questa sedimentazione, contenente la frazione arricchita ghiandolare, è stata risospesa in RPMI e placcata in fiasche di coltura tissutale per la futura co-coltura.
4. Co-coltura endometriale autologa di embrione umano Circa una quantità uguale di cellule ghiandolari e stromali è stata mescolata il giorno stimato prima della somministrazione di hCG durante il ciclo di fecondazione in vitro della paziente. Circa 3x10 ^ 5 cellule sono state seminate in una piastra di coltura tissutale a quattro pozzetti e gli zigoti sono stati collocati nel sistema di co-coltura o terreno convenzionale (liquido tubarico umano più 15% di siero materno). I tassi di scissione e l'aspetto morfologico sono stati valutati giornalmente. Gli embrioni morfologicamente migliori sono stati ritrasferiti alla paziente 72 ore dopo il prelievo, indipendentemente dal sistema di coltura. Il tasso di impianto è stato definito come il numero di sacche intrauterine con attività cardiaca fetale per numero di embrioni trasferiti. Le gravidanze cliniche includevano solo quelle gravidanze con un battito cardiaco fetale documentato sull'ecografia transvaginale entro il giorno 49.
5. La distribuzione delle citochine nel terreno di co-coltura Le citochine, comprese le citochine Th1 (IL-2 e IFN-γ), le citochine Th2 (IL-4, IL-6 e IL-10) e IL-15 sono state determinate mediante tecnica ELISA nel terreno di co-coltura prima e dopo la placcatura degli embrioni.
6. Colorazione immunocitochimica di cellule ghiandolari e stromali endometriali umane Le cellule ghiandolari e stromali endometriali purificate sono state lavate due volte con tampone di lavaggio freddo per rimuovere le citochine aderenti alle cellule. Queste cellule sono state quindi fissate sul vetrino adesivo con tampone di fissazione ghiacciato. Sono stati aggiunti l'anticorpo monoclonale anti-IL-15 coniugato con ficoeritrina o l'anticorpo anti-IL-15Rα umano biotinilato e il coniugato streptavidina-isotiocianato di fluoresceina (SAv-FITC). Il fluoroscopio è stato utilizzato per rilevare la fluorescenza emessa dai bersagli.
7. PCR in tempo reale dell'mRNA di IL-15 e IL-15Rα da cellule ghiandolari e stromali dell'endometrio umano L'RNA totale nelle cellule ghiandolari e stromali dell'endometrio è stato estratto con Trizol e trasformato in cDNA con trascrizione inversa. La PCR in tempo reale è stata eseguita utilizzando diverse sonde per ß-actina, IL-15 e IL-15Rα con ABI PRISM 7700 Sequence Detector System, come descritto sopra.