De expressie van IL-15 en zijn receptor in Decidua

De expressie van IL-15 en IL-15Rα in de lymfocyten van perifeer bloed en decidua tijdens de vroege zwangerschap

1. Verzameling van monsters Verzamel het perifere bloed en deciduale weefsel van 20-30 zwangere vrouwen met een zwangerschapsduur van 6-8 weken tijdens de D&C-procedure vanwege multipariteit.
2. Immunohistochemische kleuring van deciduale weefsel De vriescoupe van deciduale weefsel werd uitgevoerd volgens de aanbevolen procedures. Het eerste antilichaam, muis-anti-menselijk IL-15 of IL-15Ra monoklonaal antilichaam, tweede antilichaam, met peroxidase gemerkt geit-anti-muis polyklonaal antilichaam en kleurreagentia werden achtereenvolgens toegevoegd. Ten slotte werden de objectglaasjes tegengekleurd met hematoxyline.
3. Scheiding van mononucleaire cellen Decidaal weefsel en perifere bloedmonsters werden genomen van elke zwangere vrouw op het moment van abortus. Om besmetting door bloed te minimaliseren, werd het deciduale weefsel macroscopisch gescheiden van de chorionvilli, tweemaal gewassen met Hank's uitgebalanceerde zoutoplossing, in kleine stukjes gesneden, nogmaals tweemaal gewassen en door een maas van 1,9 mm geleid om het achtergebleven bloed te verwijderen zonder enzymatische behandeling. Deze monsters werden vervolgens gefilterd door een roestvrijstalen gaas van 45,7 μm om weefselresten te verwijderen. De gefiltreerde oplossing werd in een laag over een Ficoll-Paque PLUS-gradiënt aangebracht en gedurende 45 minuten bij 400 g gecentrifugeerd. Een verrijkte celsuspensie van mononucleaire cellen werd verzameld op het grensvlak en vervolgens tweemaal gewassen met RPMI-1640-medium. Perifere mononucleaire bloedcellen werden ook geïsoleerd door middel van Ficoll-Paque PLUS-sedimentatie.
4. Cytometrische analyses De expressie van intracellulair IL-15 en oppervlakte-IL-15Ra in mononucleaire cellen werd geanalyseerd met flowcytometrie. De antilichaamcombinaties omvatten: FITC/PE/PerCP-CD4/IL-15/CD3, CD8/IL-15/CD3, CD56/IL-15/CD3, CD4/IL-15Rα/CD3, CD8/IL-15Rα/CD3 , CD56/IL-15Ra/CD3.
5. Scheiding van CD4+-cellen, CD8+-cellen en NK-cellen De CD4+-cellen, CD8+-cellen en NK-cellen in perifeer bloed en deciduae werden respectievelijk gescheiden met een magnetische geactiveerde celsorteerder (MACS).
6. Real-time PCR van IL-15 en IL-15Ra mRNA Het totale RNA in CD4+-cellen, CD8+-cellen en NK-cellen werd geëxtraheerd met Trizol, en werd getransformeerd naar cDNA met reverse transcriptie. Realtime PCR werd uitgevoerd met verschillende sondes voor ß-actine, IL-15 en IL-15Rα met ABI PRISM 7700 Sequence Detector System. De primersequenties waren: ß-actine, 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA; 5' CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC; IL-15, 5'GGC TTT GAG TAA TGA GAA TTT CGA; 5' ATC AAT TGC AAT CAA GAA GTG TTG; IL-15Ra, 5' GGC GAC GCG GGG CAT CAC; 5' TCG CTG TGG CCC TGT GGA TA.

7. Functionele tests van CD4+-cellen, CD8+-cellen en NK-cellen

   1. Proliferatieve assay Door gebruik te maken van de opname van BrdU tijdens cellulaire proliferatie, werd het proliferatieve vermogen van CD4+-cellen, CD8+-cellen en NK-cellen beoordeeld wanneer verschillende concentraties van IL-15 en IL-2 werden toegevoegd.
   2. Uitscheidingsassay De concentraties van IFN-y, IL-6 en IL-10 in het supernatant werden gedetecteerd met behulp van ELISA-kits wanneer verschillende concentraties van IL-15 en IL-2 aan het kweekmedium werden toegevoegd.
   3. Op fluorescentie gebaseerde cellulaire cytotoxiciteit - FCC-assay NK- en CTL-gemedieerde cytolyse van doelcellen vormt een vorm van apoptose en gaat gepaard met veel van dezelfde gebeurtenissen, waaronder caspase-activering. We hebben het fluorogene substraat voor caspase 6 in de doelcellen (K562-cellen en autologe cytotrofoblasten) ingebouwd en de caspase-activering gemeten door de fluorescentie te detecteren die wordt uitgezonden door het gesplitste substraat.

De expressie van IL-15 en IL-15Rα in het menselijke embryo voor en na co-kweek met autoloog endometrium

1. Immunocytochemische kleuring van menselijk embryo Menselijke embryo's van het IVF-programma werden op het adhesie-objectglaasje gefixeerd met ijskoude fixatiebuffer. Het fycoerythrine-geconjugeerde anti-IL-15 monoklonale antilichaam of gebiotinyleerd anti-humaan IL-15Ra-antilichaam en streptavidine-fluoresceïne-isothiocyanaat (SAv-FITC)-conjugaat werden toegevoegd. De fluoroscoop werd gebruikt om de fluorescentie te detecteren die door de doelen werd uitgezonden.
2. Eencellige PCR van IL-15 en IL-15Rα mRNA Gebruikmakend van het principe van biotine/streptavidine "vangst", werd het embryo-mRNA geïsoleerd met Micro RNA Isolation Kit, gelabeld met biotine-gelabelde oligo dT-probe en geëxtraheerd met streptavidine-gecoate buizen. Na transformatie naar cDNA werd real-time PCR uitgevoerd met behulp van verschillende probes voor ß-actine, IL-15 en IL-15Rα met ABI PRISM 7700 Sequence Detector System, zoals hierboven beschreven.
3. Scheiding van autologe endometriumcellen Een endometriumbiopsie in de luteale fase werd uitgevoerd in een cyclus voorafgaand aan de IVF-procedure van de patiënt met een Pipelle endometriumzuigcurette. Het weefsel werd verteerd met 0,2% collagenase type 2 en men liet het bezinken door differentiële sedimentatie bij eenheidszwaartekracht. De bovenstaande stappen werden vier keer herhaald en het supernatant werd verzameld. Na differentiële sedimentatie bij eenheidszwaartekracht werd het supernatant, dat de stroma-verrijkte fractie bevatte, overgebracht naar weefselkweekflessen voor toekomstig gebruik. De stukjes weefsel, die overbleven na de vier digesties, werden opnieuw gesuspendeerd in 10 ml HBSS. Na ongeveer 30 seconden liet men de bovenste 8 ml bezinken bij eenheidszwaartekracht. Deze sedimentatie, die met klieren verrijkte fractie bevatte, werd geresuspendeerd in RPMI en uitgeplaat in weefselkweekflessen voor toekomstige co-cultuur.
4. Autologe endometriale co-cultuur van menselijk embryo Ongeveer een gelijke hoeveelheid glandulaire en stromale cellen werd gemengd op de geschatte dag vóór de toediening van hCG tijdens de IVF-cyclus van de patiënt. Ongeveer 3 x 10 ^ 5 cellen werden gezaaid in een weefselkweekplaat met vier putjes en de zygoten werden in het co-kweeksysteem of conventioneel medium (menselijke eileidersvloeistof plus 15% maternaal serum) geplaatst. De splitsingspercentages en het morfologische uiterlijk werden dagelijks beoordeeld. De morfologisch beste embryo's werden 72 uur na het ophalen teruggeplaatst bij de patiënt, ongeacht het kweeksysteem. De implantatiesnelheid werd gedefinieerd als het aantal intra-uteriene zakjes met foetale hartactiviteit per aantal teruggeplaatste embryo's. Klinische zwangerschappen omvatten alleen die zwangerschappen met een foetale hartslag gedocumenteerd op transvaginale echografie op dag 49.
5. De cytokineverdeling in co-kweekmedium De cytokines, waaronder Th1-cytokines (IL-2 en IFN-γ), Th2-cytokinen (IL-4, IL-6 en IL-10) en IL-15 werden bepaald door ELISA-techniek in de co-kweekmedium voor en na verzilverde embryo's.
6. Immunocytochemische kleuring van humane endometriumklier- en stromacellen De gezuiverde endometriumklier- en stromacellen werden tweemaal gewassen met koude wasbuffer om de aan de cellen hechtende cytokinen te verwijderen. Deze cellen werden vervolgens gefixeerd op het adhesieglaasje met ijskoude fixatiebuffer. Het met fyco-erythrine geconjugeerde anti-IL-15 monoklonale antilichaam of gebiotinyleerd anti-humaan IL-15Ra-antilichaam en streptavidine-fluoresceïne-isothiocyanaat (SAv-FITC)-conjugaat werden toegevoegd. De fluoroscoop werd gebruikt om de fluorescentie te detecteren die door de doelen werd uitgezonden.
7. Realtime PCR van IL-15- en IL-15Ra-mRNA uit humane endometriumklier- en stromacellen Het totale RNA in endometriumklier- en stromacellen werd geëxtraheerd met Trizol en getransformeerd naar cDNA met omgekeerde transcriptie. Realtime PCR werd uitgevoerd met verschillende sondes voor ß-actine, IL-15 en IL-15Rα met ABI PRISM 7700 Sequence Detector System, zoals hierboven beschreven.