Экспрессия IL-15 и его рецептора в децидуальной оболочке

Экспрессия IL-15 и IL-15Rα в лимфоцитах периферической крови и децидуальной оболочки на ранних сроках беременности

1. Сбор образцов Соберите периферическую кровь и децидуальную ткань от 20-30 беременных женщин 6-8 недель гестационного возраста во время процедуры D&C из-за многоплодия.
2. Иммуногистохимическое окрашивание децидуальной ткани Замороженный срез децидуальной ткани выполняли по рекомендуемым методикам. Последовательно добавляли первое антитело, мышиное моноклональное антитело против человеческого IL-15 или IL-15Rα, второе антитело, меченное пероксидазой козье антимышиное поликлональное антитело и окрашивающие реагенты. Наконец, слайды были контрастно окрашены гематоксилином.
3. Выделение мононуклеаров Образцы децидуальной ткани и периферической крови брали у каждой беременной во время аборта. Для минимизации контаминации кровью децидуальную ткань макроскопически отделяли от ворсин хориона, дважды промывали сбалансированным солевым раствором Хенкса, разрезали на мелкие кусочки, снова дважды промывали и пропускали через сетку 1,9 мм для удаления остатков крови без ферментативное лечение. Затем эти образцы фильтровали через сетку из нержавеющей стали с размером ячеек 45,7 мкм для удаления остатков тканей. Отфильтрованный раствор наслаивали на градиент Ficoll-Paque PLUS и центрифугировали в течение 45 минут при 400 g. Обогащенную клеточную суспензию мононуклеаров собирали на границе раздела и дважды промывали средой RPMI-1640. Мононуклеарные клетки периферической крови также выделяли методом седиментации Ficoll-Paque PLUS.
4. Цитометрический анализ Экспрессию внутриклеточного IL-15 и поверхностного IL-15Rα в мононуклеарных клетках анализировали с помощью проточной цитометрии. Комбинации антител включали: FITC/PE/PerCP-CD4/IL-15/CD3, CD8/IL-15/CD3, CD56/IL-15/CD3, CD4/IL-15Rα/CD3, CD8/IL-15Rα/CD3. , CD56/IL-15Rα/CD3.
5. Разделение клеток CD4+, клеток CD8+ и NK-клеток. Клетки CD4+, клетки CD8+ и NK-клетки в периферической крови и децидуальной оболочке разделяли соответственно с помощью магнитно-активируемого клеточного сортера (MACS).
6. ПЦР в реальном времени мРНК IL-15 и IL-15Rα. Суммарную РНК в клетках CD4+, клетках CD8+ и NK-клетках экстрагировали тризолом и трансформировали в кДНК с обратной транскрипцией. ПЦР в реальном времени проводили с использованием различных зондов для ß-актина, IL-15 и IL-15Rα с помощью системы обнаружения последовательностей ABI PRISM 7700. Последовательности праймеров были следующими: β-актин, 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA; 5' CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC; Ил-15, 5' ГГК ТТТ ГАГ ТАА ТГА ГАА ТТТ ЦГА; 5' УВД ААТ ТГК ААТ САА ГАА ГТГ ТТГ; IL-15Rα, 5' GGC GAC GCG GGG CAT CAC; 5' TCG CTG TGG CCC TGT GGA TA.

7. Функциональные тесты клеток CD4+, клеток CD8+ и NK-клеток

   1. Пролиферативный анализ Используя включение BrdU во время клеточной пролиферации, оценивали пролиферативную способность клеток CD4+, клеток CD8+ и NK-клеток при добавлении различных концентраций IL-15 и IL-2.
   2. Анализ секреции Концентрации IFN-γ, IL-6 и IL-10 в супернатанте определяли с помощью наборов ELISA, когда в культуральную среду добавляли различные концентрации IL-15 и IL-2.
   3. Анализ клеточной цитотоксичности на основе флуоресценции - FCC-анализ NK- и CTL-опосредованный цитолиз клеток-мишеней представляет собой форму апоптоза и сопровождается многими из тех же событий, включая активацию каспазы. Мы включили флуорогенный субстрат для каспазы 6 в клетки-мишени (клетки K562 и аутологичные цитотрофобласты) и измерили активацию каспазы, обнаружив флуоресценцию, испускаемую расщепленным субстратом.

Экспрессия IL-15 и IL-15Rα в эмбрионе человека до и после совместного культивирования с аутологичным эндометрием

1. Иммуноцитохимическое окрашивание эмбрионов человека Эмбрионы человека из программы ЭКО фиксировали на предметном стекле с помощью охлажденного на льду буфера для фиксации. Добавляли моноклональное антитело против IL-15, конъюгированное с фикоэритрином, или биотинилированное антитело против человеческого IL-15Rα и конъюгат стрептавидин-флуоресцеинизотиоцианат (SAv-FITC). Флюороскоп использовался для обнаружения флуоресценции, испускаемой мишенями.
2. ПЦР одиночных клеток мРНК IL-15 и IL-15Rα Используя принцип «захвата» биотина/стрептавидина, мРНК эмбриона выделяли с помощью набора для выделения микроРНК, метили биотин-меченым олиго-dT-зондом и экстрагировали с помощью покрытого стрептавидином трубы. После трансформации в кДНК проводили ПЦР в реальном времени с использованием различных зондов для ß-актина, IL-15 и IL-15Rα с помощью системы обнаружения последовательностей ABI PRISM 7700, как описано выше.
3. Выделение аутологичных клеток эндометрия Биопсия эндометрия в лютеиновой фазе выполнялась в цикле перед процедурой ЭКО пациентки с помощью кюретки для аспирации эндометрия Pipelle. Ткань расщепляли 0,2% коллагеназой типа 2 и давали осесть путем дифференциального осаждения при единице силы тяжести. Описанные выше шаги повторяли четыре раза и собирали супернатант. После дифференциального осаждения при единице силы тяжести надосадочную жидкость, содержащую фракцию, обогащенную стромой, переносили в колбы для тканевых культур для дальнейшего использования. Кусочки ткани, оставшиеся после четырех переваров, ресуспендировали в 10 мл HBSS. Приблизительно через 30 секунд верхние 8 мл давали осесть при единице силы тяжести. Этот осадок, содержащий обогащенную железами фракцию, ресуспендировали в RPMI и помещали в колбы для тканевых культур для будущего совместного культивирования.
4. Кокультура аутологичного эндометрия эмбриона человека Примерно равное количество железистых и стромальных клеток смешивали за предполагаемый день до введения ХГЧ во время цикла ЭКО пациентки. Около 3x10^5 клеток высевали в четырехлуночный планшет для культивирования тканей, а зиготы помещали в систему совместного культивирования или в обычную среду (жидкость из маточных труб человека плюс 15% материнской сыворотки). Скорость расщепления и морфологический вид оценивали ежедневно. Морфологически лучшие эмбрионы были перенесены обратно пациенту через 72 часа после извлечения независимо от системы культивирования. Частота имплантации определялась как количество внутриматочных мешков с сердечной активностью плода на количество перенесенных эмбрионов. Клинические беременности включали только те беременности, у которых сердцебиение плода было документировано при трансвагинальном УЗИ на 49-й день.
5. Распределение цитокинов в среде совместного культивирования. Цитокины, включая цитокины Th1 (ИЛ-2 и ИФН-γ), цитокины Th2 (ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10) и ИЛ-15, определяли методом ELISA в среда для совместного культивирования до и после посева эмбрионов.
6. Иммуноцитохимическое окрашивание эндометриальных железистых и стромальных клеток человека. Очищенные эндометриальные железистые и стромальные клетки дважды промывали холодным промывочным буфером для удаления цитокинов, прилипших к клеткам. Затем эти клетки фиксировали на предметном стекле для адгезии охлажденным льдом буфером для фиксации. Добавляли моноклональное антитело против IL-15, конъюгированное с фикоэритрином, или биотинилированное антитело против человеческого IL-15Rα и конъюгат стрептавидин-флуоресцеинизотиоцианат (SAv-FITC). Флюороскоп использовался для обнаружения флуоресценции, испускаемой мишенями.
7. ПЦР в реальном времени мРНК IL-15 и IL-15Rα из железистых и стромальных клеток эндометрия человека. Суммарную РНК из железистых и стромальных клеток эндометрия экстрагировали тризолом и трансформировали в кДНК с обратной транскрипцией. ПЦР в реальном времени выполняли с использованием различных зондов для ß-актина, IL-15 и IL-15Rα с помощью системы обнаружения последовательностей ABI PRISM 7700, как описано выше.