Autologní ex vivo expanze spojivkových epiteliálních buněk pro transplantaci očního povrchu

Ex-vivo autologní expanze spojivky na lidské amniotické membráně (HAM), následovaná klinickou transplantační operací

Příprava HAM. Lidská amniotická membrána (HAM) připravená pro lidské použití bude získána od Singapore Eye Bank. HAM se rychle rozmrazí ve vodní lázni o teplotě 37 °C a promyje se fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem. Amniotický epitel bude odstraněn kombinací dispase digesce a mechanického seškrábnutí. Úplné odstranění amniotických epiteliálních buněk bude potvrzeno mikroskopií. HAM se poté umístí na kultivační misku spodní membránou nahoru a před použitím se přes noc inkubuje s DMEM při 37 °C v atmosféře 5 % CO2 a 95 % vzduchu.

Ex-vivo expanze spojivkových buněk na HAM. U pacientů podstupujících operaci pterygia bude provedena forniceální biopsie spojivky. Tkáň bude kultivována na HAM buď jako buněčná suspenze nebo jako explantáty, metodami popsanými výše. Médium se mění každé 2 dny a kultura se udržuje po dobu 2-3 týdnů. Buňky vytvoří splývající list a začnou se stratifikovat a diferencovat. Tkáň se poté zvedne na rozhraní vzduch-kapalina, aby se podpořila diferenciace.

Histologická analýza. Vrstvy spojivkových epiteliálních buněk na amniové membráně budou zkoumány světelnou mikroskopií. Vzorky tkáně budou fixovány a zpracovány pomocí standardních histologických postupů a barveny reagenciemi H&E a PAS. Bude provedeno elektronové mikroskopické vyšetření tkáně. Řezy budou také podrobeny imunohistochemické analýze cytokeratinových markerů.

Klinická transplantace kultivovaných epiteliálních buněk spojivky na HAM

Příprava kultivovaných buněk spojivky na amniové membráně Pro úvodní sérii transplantací budou vybráni pacienti s různými poruchami očního povrchu. Všichni pacienti podstoupí úplné poradenství pro informovaný souhlas s procedurami. Na kontralaterálním zdravém oku bude provedena forniceální biopsie spojivky. PI bude u těchto pacientů provádět transplantace autologní spojivkové fólie pěstované na lidské amniové membráně. Nemocná oblast bude vyříznuta standardní chirurgickou technikou. Defekt bude překryt vrstvou kultivovaných spojivkových buněk na HAM epitelovou stranou nahoru. Štěp je zajištěn k přilehlé spojivce přerušovanými vikrylovými stehy 8/0. K ochraně tkáně před traumatem víčka se umístí planoterapeutická bandážová kontaktní čočka. Topické steroidní a antibiotické oční kapky budou podávány denně ke snížení očního zánětu. Přežívání spojivky na amniové membráně bude pečlivě sledováno a pacientky budou sledovány ve 3 měsíčních intervalech až do jednoho roku. Během těchto návštěv budou těmto pacientům pořízeny fotografie předního segmentu a barvení fluoresceinem, aby bylo možné sledovat postup hojení.

Transplantace mohou být také prováděny u vybraných pacientů s onemocněním očního povrchu, například očním jizvaným pemfigoidem, Stevens Johnsonovým syndromem a alkálií. U těchto závažných stavů se tento postup může ukázat jako důležitý doplněk jiných postupů, jako je transplantace limbálních kmenových buněk. Pokud bude úvodní studie úspěšná, bude naplánována randomizovaná klinická studie srovnávající tento postup s konvenčním autograftem spojivky a konvenční transplantací amniové membrány. Pokud se tedy zjistí, že je úspěšná, transplantace kultivovaných buněk spojivky na HAM může být nakonec použita jako primární postup nebo jako doplňkový postup pro tyto vizuálně oslabující stavy.