Expansão autóloga ex vivo de células epiteliais conjuntivais para transplante de superfície ocular

Expansão da conjuntiva autóloga ex-vivo na membrana amniótica humana (MAH), seguida de cirurgia de transplante clínico

Preparação de HAM. A membrana amniótica humana (HAM) preparada para uso humano será obtida do Singapore Eye Bank. O HAM será rapidamente descongelado em banho-maria a 37oC e lavado com solução salina tamponada com fosfato. O epitélio amniótico será removido usando uma combinação de digestão com Dispase e raspagem mecânica. A remoção completa das células epiteliais amnióticas será confirmada por microscopia. O HAM é então colocado em uma placa de cultura, com o lado da membrana basal para cima, e incubado com DMEM a 37oC em uma atmosfera de 5% de CO2 e 95% de ar durante a noite antes do uso.

Expansão ex-vivo de células conjuntivais em HAM. Uma biópsia conjuntival fornical será realizada em pacientes submetidos à cirurgia de pterígio. O tecido será cultivado no HAM como uma suspensão de células ou como explantes, com os métodos descritos acima. O meio é trocado a cada 2 dias e a cultura é mantida por 2-3 semanas. As células formarão uma folha confluente e começarão a se estratificar e se diferenciar. O tecido será então elevado a uma interface ar-líquido para promover a diferenciação.

Análise histológica. As camadas de células epiteliais conjuntivais na membrana amniótica serão examinadas por microscopia de luz. Amostras do tecido serão fixadas e processadas com o uso de procedimentos histológicos padrão e coradas com reagentes H&E e PAS. O exame de microscopia eletrônica será realizado para o tecido. Os cortes também serão submetidos à análise imuno-histoquímica para marcadores de citoqueratina.

Transplante clínico de células epiteliais conjuntivais cultivadas em HAM

Preparação de células conjuntivais cultivadas na membrana amniótica Pacientes com vários distúrbios da superfície ocular serão selecionados para a série inicial de transplantes. Todos os pacientes serão submetidos a aconselhamento completo para consentimento informado para os procedimentos. Uma biópsia conjuntival fórnice será realizada no olho saudável contralateral. A PI realizará os transplantes de lâmina conjuntival autóloga cultivada em membrana amniótica humana nesses pacientes. A área doente será excisada usando a técnica cirúrgica padrão. O defeito será coberto com a folha de células conjuntivais cultivadas no HAM com o lado epitelial para cima. O enxerto é fixado à conjuntiva adjacente com suturas de vicryl 8/0 interrompidas. Uma lente de contato planoterapêutica é colocada para proteger o tecido do trauma palpebral. Colírios tópicos de esteroides e antibióticos serão administrados diariamente para reduzir a inflamação ocular. A sobrevivência da conjuntiva na membrana amniótica será monitorada de perto e os pacientes serão acompanhados em intervalos de 3 meses até um ano. Durante essas visitas, esses pacientes terão fotografias do segmento anterior tiradas e coloração com fluoresceína para monitorar o progresso da cicatrização.

Os transplantes também podem ser realizados em pacientes selecionados com doença da superfície ocular, por exemplo, penfigóide cicatricial ocular, síndrome de Stevens Johnson e lesão alcalina. Para essas condições graves, esse procedimento pode ser um complemento importante para outros procedimentos, como o transplante de células-tronco do limbo. Se o estudo inicial for bem-sucedido, será planejado um ensaio clínico randomizado comparando esse procedimento com o autoenxerto conjuntival convencional e o transplante convencional de membrana amniótica. Portanto, se for considerado bem-sucedido, o transplante de células conjuntivais cultivadas em HAM pode eventualmente ser usado como procedimento primário ou como procedimento adjuvante para essas condições visualmente debilitantes.