Autolog ex Vivo konjunktival epitelcelleudvidelse til øjenoverfladetransplantation

Ex-vivo autolog conjunctiva ekspansion på human fosterhinde (HAM), efterfulgt af klinisk transplantationskirurgi

Udarbejdelse af HAM. Human amniotic membrane (HAM) forberedt til human brug vil blive anskaffet fra Singapore Eye Bank. HAM vil hurtigt blive optøet i et 37oC vandbad og vasket med fosfatbufret saltvand. Fostervandsepitelet vil blive fjernet ved hjælp af en kombination af Dispase-fordøjelse og mekanisk skrabning. Fuldstændig fjernelse af amniotiske epitelceller vil blive bekræftet ved mikroskopi. HAM placeres derefter på en kulturplade med basalmembransiden opad og inkuberes med DMEM ved 37oC i en atmosfære af 5 % CO2 og 95 % luft natten over før brug.

Ex-vivo ekspansion af konjunktivale celler på HAM. En forniceal konjunktival biopsi vil blive udført hos patienter, der gennemgår en pterygiumoperation. Vævet vil blive dyrket på HAM enten som en cellesuspension eller som eksplantater med metoderne beskrevet ovenfor. Medierne skiftes hver 2. dag, og kulturen opretholdes i 2-3 uger. Cellerne vil danne et sammenflydende ark og begynde at stratificere og differentiere. Vævet vil derefter blive hævet til en luft-væske grænseflade for at fremme differentiering.

Histologisk analyse. De konjunktivale epitelcelleplader på fosterhinden vil blive undersøgt ved lysmikroskopi. Prøver af vævet vil blive fikseret og behandlet ved brug af standard histologiske procedurer og farvet med H&E og PAS reagenser. Elektronmikroskopisk undersøgelse vil blive udført for vævet. Sektionerne vil også blive udsat for immunhistokemisk analyse for cytokeratinmarkører.

Klinisk transplantation af dyrkede konjunktivale epitelceller på HAM

Forberedelse af dyrkede bindehindeceller på fosterhinde Patienter med forskellige øjenoverfladelidelser vil blive udvalgt til den indledende serie af transplantationer. Alle patienter vil gennemgå fuld rådgivning for informeret samtykke til procedurerne. En forniceal konjunktival biopsi vil blive udført på det kontralaterale raske øje. PI vil udføre transplantationerne af autologt bindehindelag dyrket på human fosterhinde hos disse patienter. Det syge område vil blive skåret ud ved hjælp af standard kirurgisk teknik. Defekten vil blive dækket med arket af dyrkede konjunktivale celler på HAM med epitelsiden opad. Graftet fastgøres til den tilstødende bindehinde med afbrudte 8/0 vicryl suturer. En planoterapeutisk bandage kontaktlinse er placeret for at beskytte vævet mod lågtraumer. Aktuelle steroid- og antibiotiske øjendråber vil blive administreret dagligt for at reducere øjenbetændelse. Overlevelse af bindehinde på fosterhinden vil blive nøje overvåget, og patienterne vil blive fulgt op med 3 månedlige intervaller op til et år. Under disse besøg vil disse patienter få taget forreste segmentfotografier og fluoresceinfarvning for at overvåge helingens fremskridt.

Transplantationer kan også udføres på udvalgte patienter med øjenoverfladesygdom, for eksempel okulær cicatricial pemfigoid, Stevens Johnsons syndrom og alkaliskader. For disse alvorlige tilstande kan denne procedure vise sig at være et vigtigt supplement til andre procedurer, såsom limbal stamcelletransplantation. Hvis den indledende undersøgelse er vellykket, vil et randomiseret klinisk forsøg, der sammenligner denne procedure med konventionel konjunktival autografting og konventionel fosterhindetransplantation, blive planlagt. Derfor, hvis det viser sig at være vellykket, kan transplantation af dyrkede konjunktivale celler på HAM i sidste ende bruges som en primær procedure eller som en supplerende procedure til disse visuelt svækkende tilstande.