Ekspansja autologicznych ex vivo komórek nabłonka spojówki do przeszczepów powierzchni oka

Ekspansja autologicznej spojówki ex vivo na ludzkiej błonie owodniowej (HAM), a następnie kliniczna operacja przeszczepu

Przygotowanie SZYNKI. Ludzka błona owodniowa (HAM) przygotowana do użytku przez ludzi zostanie uzyskana z Singapore Eye Bank. SZYNKA zostanie szybko rozmrożona w łaźni wodnej o temperaturze 37oC i przemyta solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Nabłonek owodniowy zostanie usunięty przy użyciu kombinacji trawienia Dispase i mechanicznego skrobania. Całkowite usunięcie komórek nabłonka owodni zostanie potwierdzone mikroskopowo. Następnie HAM umieszcza się na płytce hodowlanej, stroną z błoną podstawną do góry, i inkubuje z DMEM w 37oC w atmosferze 5% CO2 i 95% powietrza przez noc przed użyciem.

Ekspansja ex vivo komórek spojówki na HAM. U pacjentów poddawanych operacji skrzydlika zostanie wykonana biopsja spojówki przedsionkowej. Tkanka będzie hodowana na HAM jako zawiesina komórkowa lub jako eksplantaty metodami opisanymi powyżej. Pożywkę zmienia się co 2 dni, a hodowlę utrzymuje się przez 2-3 tygodnie. Komórki utworzą zlewający się arkusz i zaczną się rozwarstwiać i różnicować. Tkanka zostanie następnie podniesiona do granicy faz powietrze-ciecz, aby promować różnicowanie.

Analiza histologiczna. Arkusze komórek nabłonka spojówki na błonie owodniowej zostaną zbadane za pomocą mikroskopii świetlnej. Próbki tkanek zostaną utrwalone i poddane obróbce z wykorzystaniem standardowych procedur histologicznych oraz wybarwione odczynnikami H&E i PAS. Zostanie przeprowadzone badanie mikroskopowe tkanki. Skrawki zostaną również poddane analizie immunohistochemicznej pod kątem markerów cytokeratynowych.

Transplantacja kliniczna hodowanych komórek nabłonka spojówki na HAM

Przygotowanie hodowanych komórek spojówki na błonie owodniowej Pacjenci z różnymi zaburzeniami powierzchni oka zostaną wybrani do wstępnej serii przeszczepów. Wszyscy pacjenci przejdą pełne doradztwo w celu uzyskania świadomej zgody na zabiegi. Na drugim zdrowym oku zostanie przeprowadzona biopsja spojówki. U tych pacjentów PI wykona przeszczep autologicznej warstwy spojówki wyhodowanej na ludzkiej błonie owodniowej. Chory obszar zostanie wycięty przy użyciu standardowej techniki chirurgicznej. Ubytek zostanie przykryty arkuszem hodowanych komórek spojówki na HAM stroną nabłonkową do góry. Przeszczep mocuje się do sąsiedniej spojówki za pomocą przerywanych szwów vicrylowych 8/0. Zakłada się planoterapeutyczną soczewkę kontaktową bandaża, aby chronić tkankę przed urazem powieki. Miejscowe krople do oczu steroidowe i antybiotykowe będą podawane codziennie w celu zmniejszenia stanu zapalnego oka. Przeżycie spojówki na błonie owodniowej będzie ściśle monitorowane, a pacjenci będą kontrolowani w odstępach 3-miesięcznych do jednego roku. Podczas tych wizyt pacjentom tym zostaną wykonane zdjęcia odcinka przedniego i barwienie fluoresceiną w celu monitorowania postępu gojenia.

Transplantacje można również przeprowadzać u wybranych pacjentów z chorobą powierzchni oka, na przykład pemfigoidem bliznowaciejącym oka, zespołem Stevensa-Johnsona i uszkodzeniem alkalicznym. W tych ciężkich stanach procedura ta może okazać się ważnym uzupełnieniem innych procedur, takich jak przeszczep komórek macierzystych rąbka. Jeśli wstępne badanie zakończy się sukcesem, zaplanowane zostanie randomizowane badanie kliniczne porównujące tę procedurę z konwencjonalnym autoprzeszczepem spojówki i konwencjonalnym przeszczepem błony owodniowej. Dlatego, jeśli okaże się, że się powiodło, przeszczep hodowanych komórek spojówki na HAM może ostatecznie zostać zastosowany jako procedura podstawowa lub jako procedura pomocnicza w tych upośledzających wzrok stanach.