Autologe Ex-vivo-Expansion von konjunktivalen Epithelzellen für die Augenoberflächentransplantation

Ex-vivo autologe Bindehautexpansion auf menschlicher Amnionmembran (HAM), gefolgt von einer klinischen Transplantationsoperation

Zubereitung von SCHINKEN. Für den menschlichen Gebrauch vorbereitete menschliche Amnionmembran (HAM) wird von der Singapore Eye Bank bezogen. SCHINKEN wird schnell in einem Wasserbad von 37 °C aufgetaut und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Das Amnionepithel wird mit einer Kombination aus Dispase-Verdauung und mechanischem Schaben entfernt. Die vollständige Entfernung der amniotischen Epithelzellen wird durch Mikroskopie bestätigt. Das HAM wird dann mit der Basalmembranseite nach oben auf eine Kulturplatte gelegt und vor der Verwendung über Nacht mit DMEM bei 37 °C in einer Atmosphäre aus 5 % CO2 und 95 % Luft inkubiert.

Ex-vivo-Expansion von Bindehautzellen auf HAM. Bei Patienten, die sich einer Operation am Pterygium unterziehen, wird eine forniceale Konjunktivalbiopsie durchgeführt. Das Gewebe wird auf dem HAM entweder als Zellsuspension oder als Explantate mit den oben beschriebenen Verfahren kultiviert. Das Medium wird alle 2 Tage gewechselt und die Kultur 2-3 Wochen lang aufrechterhalten. Die Zellen bilden ein konfluentes Blatt und beginnen sich zu schichten und zu differenzieren. Das Gewebe wird dann an eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche angehoben, um die Differenzierung zu fördern.

Histologische Analyse. Die konjunktivalen Epithelzellschichten auf der Amnionmembran werden lichtmikroskopisch untersucht. Proben des Gewebes werden fixiert und unter Verwendung histologischer Standardverfahren verarbeitet und mit H&E- und PAS-Reagenzien gefärbt. Das Gewebe wird elektronenmikroskopisch untersucht. Die Schnitte werden auch einer immunhistochemischen Analyse auf Cytokeratin-Marker unterzogen.

Klinische Transplantation kultivierter konjunktivaler Epithelzellen auf HAM

Präparation kultivierter Bindehautzellen auf Amnionmembran Patienten mit verschiedenen Erkrankungen der Augenoberfläche werden für die erste Reihe von Transplantationen ausgewählt. Alle Patienten werden umfassend beraten, um ihre Zustimmung zu den Verfahren zu erhalten. Am kontralateralen gesunden Auge wird eine forniceale Bindehautbiopsie durchgeführt. PI wird bei diesen Patienten die Transplantation der autologen Bindehautfolie durchführen, die auf menschlicher Amnionmembran gewachsen ist. Der erkrankte Bereich wird mit der üblichen Operationstechnik entfernt. Der Defekt wird mit der Schicht aus kultivierten Bindehautzellen auf dem HAM mit der Epithelseite nach oben abgedeckt. Das Transplantat wird mit unterbrochenen 8/0-Vicrylnähten an der angrenzenden Bindehaut befestigt. Zum Schutz des Gewebes vor Lidverletzungen wird eine planotherapeutische Verbandskontaktlinse eingesetzt. Topische Steroide und antibiotische Augentropfen werden täglich verabreicht, um die Augenentzündung zu reduzieren. Das Überleben der Bindehaut auf der Amnionmembran wird engmaschig überwacht und die Patienten werden in 3-Monats-Intervallen bis zu einem Jahr nachuntersucht. Während dieser Besuche werden bei diesen Patienten Fotos des vorderen Segments gemacht und Fluorescein-Färbungen gemacht, um den Heilungsfortschritt zu überwachen.

Transplantationen können auch bei ausgewählten Patienten mit Erkrankungen der Augenoberfläche durchgeführt werden, z. B. okuläres Narbenpemphigoid, Stevens-Johnson-Syndrom und Alkalischädigung. Bei diesen schweren Erkrankungen kann sich dieses Verfahren als wichtige Ergänzung zu anderen Verfahren, wie z. B. der Limbus-Stammzelltransplantation, erweisen. Wenn die erste Studie erfolgreich ist, ist eine randomisierte klinische Studie geplant, in der dieses Verfahren mit der konventionellen Autotransplantation der Bindehaut und der konventionellen Amnionmembrantransplantation verglichen wird. Daher kann die Transplantation von kultivierten Bindehautzellen auf HAM, wenn sie sich als erfolgreich herausstellt, schließlich als primäres Verfahren oder als ergänzendes Verfahren für diese sehschwächenden Zustände verwendet werden.