Expansión de células epiteliales conjuntivales autólogas ex vivo para trasplante de superficie ocular

Expansión de conjuntiva autóloga ex vivo en membrana amniótica humana (HAM), seguida de cirugía de trasplante clínico

Elaboración de JAMÓN. La membrana amniótica humana (HAM) preparada para uso humano se obtendrá del Banco de Ojos de Singapur. El HAM se descongelará rápidamente en un baño de agua a 37oC y se lavará con solución salina tamponada con fosfato. El epitelio amniótico se eliminará mediante una combinación de digestión con Dispase y raspado mecánico. La eliminación completa de las células epiteliales amnióticas se confirmará mediante microscopía. Luego, el HAM se coloca en una placa de cultivo, con el lado de la membrana basal hacia arriba, y se incuba con DMEM a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2 y 95 % de aire durante la noche antes de su uso.

Expansión ex vivo de células conjuntivales en HAM. Se realizará una biopsia conjuntival forniceal en pacientes sometidos a cirugía de pterigión. El tejido se cultivará en HAM como suspensión celular o como explantes, con los métodos descritos anteriormente. El medio se cambia cada 2 días y el cultivo se mantiene durante 2-3 semanas. Las células formarán una lámina confluente y comenzarán a estratificarse y diferenciarse. Luego, el tejido se elevará a una interfaz aire-líquido para promover la diferenciación.

Análisis histológico. Las láminas de células epiteliales conjuntivales en la membrana amniótica se examinarán mediante microscopía óptica. Las muestras del tejido se fijarán y procesarán con el uso de procedimientos histológicos estándar y se tiñerán con reactivos H&E y PAS. Se llevará a cabo un examen microscópico electrónico para el tejido. Las secciones también se someterán a análisis inmunohistoquímicos para marcadores de citoqueratina.

Trasplante clínico de células epiteliales conjuntivales cultivadas en HAM

Preparación de células conjuntivales cultivadas en membrana amniótica Se seleccionarán pacientes con diversos trastornos de la superficie ocular para la serie inicial de trasplantes. Todos los pacientes se someterán a un asesoramiento completo para obtener el consentimiento informado para los procedimientos. Se realizará una biopsia conjuntival del fornice en el ojo sano contralateral. PI realizará los trasplantes de láminas conjuntivales autólogas cultivadas en membrana amniótica humana en estos pacientes. El área enferma se extirpará utilizando la técnica quirúrgica estándar. El defecto se cubrirá con la lámina de células conjuntivales cultivadas en el HAM con el lado epitelial hacia arriba. El injerto se asegura a la conjuntiva adyacente con suturas interrumpidas de vicryl 8/0. Se coloca una lente de contacto de vendaje planoterapéutico para proteger el tejido del trauma del párpado. Se administrarán diariamente colirios tópicos con esteroides y antibióticos para reducir la inflamación ocular. Se controlará de cerca la supervivencia de la conjuntiva en la membrana amniótica y se realizará un seguimiento de los pacientes a intervalos de 3 meses hasta un año. Durante estas visitas, a estos pacientes se les tomarán fotografías del segmento anterior y tinción con fluoresceína para controlar el progreso de la cicatrización.

También se pueden realizar trasplantes en pacientes seleccionados con enfermedad de la superficie ocular, por ejemplo, penfigoide cicatricial ocular, síndrome de Stevens Johnson y lesión por álcalis. Para estas afecciones graves, este procedimiento puede resultar un complemento importante de otros procedimientos, como el trasplante de células madre del limbo. Si el estudio inicial tiene éxito, se planificará un ensayo clínico aleatorizado que compare este procedimiento con el autoinjerto conjuntival convencional y el trasplante de membrana amniótica convencional. Por lo tanto, si tiene éxito, el trasplante de células conjuntivales cultivadas en HAM puede eventualmente usarse como un procedimiento primario o como un procedimiento adyuvante para estas condiciones debilitantes de la vista.