Аутологичная экспансия эпителиальных клеток конъюнктивы ex Vivo для трансплантации поверхности глаза

Расширение аутологичной конъюнктивы ex-vivo на амниотической мембране человека (HAM) с последующей клинической операцией по трансплантации

Приготовление ВАМ. Амниотическая мембрана человека (HAM), подготовленная для использования человеком, будет получена из Сингапурского банка глаз. HAM быстро размораживают на водяной бане при 37°C и промывают фосфатно-солевым буфером. Амниотический эпителий будет удален с использованием комбинации расщепления Dispase и механического соскабливания. Полное удаление амниотических эпителиальных клеток будет подтверждено микроскопией. Затем HAM помещают на планшет для культивирования базальной мембраной вверх и инкубируют с DMEM при 37°C в атмосфере 5% CO2 и 95% воздуха в течение ночи перед использованием.

Расширение клеток конъюнктивы ex-vivo на HAM. Биопсия свода конъюнктивы будет выполняться у пациентов, перенесших операцию по удалению птеригиума. Ткань будет культивироваться на HAM либо в виде клеточной суспензии, либо в виде эксплантатов с помощью методов, описанных выше. Среду меняют каждые 2 дня и культуру поддерживают в течение 2-3 недель. Клетки образуют сливающийся слой и начинают расслаиваться и дифференцироваться. Затем ткань будет поднята до границы раздела воздух-жидкость, чтобы способствовать дифференциации.

Гистологический анализ. Листы эпителиальных клеток конъюнктивы на амниотической мембране будут исследованы с помощью световой микроскопии. Образцы ткани будут зафиксированы и обработаны с использованием стандартных гистологических процедур и окрашены реагентами H&E и PAS. Будет проведено электронно-микроскопическое исследование ткани. Срезы также будут подвергнуты иммуногистохимическому анализу на маркеры цитокератина.

Клиническая трансплантация культивированных эпителиальных клеток конъюнктивы на ХАМ

Приготовление культивированных клеток конъюнктивы на амниотической оболочке Пациенты с различными нарушениями поверхности глаза будут отобраны для начальной серии трансплантаций. Все пациенты пройдут полное консультирование для информированного согласия на процедуры. Биопсия свода конъюнктивы будет выполнена на контралатеральном здоровом глазу. PI проведет трансплантацию аутологичных конъюнктивальных листов, выращенных на амниотической мембране человека, у этих пациентов. Больной участок иссекается с использованием стандартной хирургической техники. Дефект будет покрыт пластом культивируемых конъюнктивальных клеток на ХАМ эпителиальной стороной вверх. Трансплантат фиксируют к прилегающей конъюнктиве узловыми швами викриловой нитью 8/0. Контактная линза с планотерапевтической повязкой накладывается для защиты тканей век от травм. Ежедневно будут вводиться местные глазные капли со стероидами и антибиотиками, чтобы уменьшить воспаление глаз. Приживаемость конъюнктивы на амниотической мембране будет тщательно контролироваться, и пациенты будут наблюдаться с интервалом в 3 месяца в течение одного года. Во время этих посещений этим пациентам будут делать фотографии переднего отрезка глаза и окрашивать их флуоресцеином для наблюдения за ходом заживления.

Трансплантации также могут быть выполнены у отдельных пациентов с заболеванием глазной поверхности, например, глазным рубцовым пемфигоидом, синдромом Стивенса-Джонсона и щелочным повреждением. В этих тяжелых условиях эта процедура может оказаться важным дополнением к другим процедурам, таким как трансплантация лимбальных стволовых клеток. Если начальное исследование будет успешным, будет запланировано рандомизированное клиническое исследование, в котором эта процедура будет сравниваться с обычной аутотрансплантацией конъюнктивы и обычной трансплантацией амниотической мембраны. Поэтому, если будет доказано, что трансплантация культивированных клеток конъюнктивы на HAM может в конечном итоге использоваться в качестве основной процедуры или в качестве дополнительной процедуры для этих визуально изнурительных состояний.