Espansione cellulare epiteliale congiuntivale autologa ex vivo per trapianto di superficie oculare

Espansione della congiuntiva autologa ex-vivo sulla membrana amniotica umana (HAM), seguita da intervento chirurgico di trapianto clinico

Preparazione del PROSCIUTTO. La membrana amniotica umana (HAM) preparata per uso umano sarà ottenuta dalla Singapore Eye Bank. HAM sarà rapidamente scongelato in un bagno d'acqua a 37°C e lavato con soluzione salina tamponata con fosfato. L'epitelio amniotico sarà rimosso utilizzando una combinazione di digestione Dispase e raschiamento meccanico. La rimozione completa delle cellule epiteliali amniotiche sarà confermata mediante microscopia. L'HAM viene quindi posto su una piastra di coltura, con la membrana basale rivolta verso l'alto, e incubato con DMEM a 37°C in un'atmosfera al 5% di CO2 e al 95% di aria durante la notte prima dell'uso.

Espansione ex vivo delle cellule congiuntivali su HAM. Una biopsia congiuntivale fornice sarà eseguita in pazienti sottoposti a chirurgia del pterigio. Il tessuto sarà coltivato sull'HAM sia come sospensione cellulare che come espianti, con le metodiche sopra descritte. Il terreno viene cambiato ogni 2 giorni e la coltura viene mantenuta per 2-3 settimane. Le cellule formeranno un foglio confluente e cominceranno a stratificarsi e differenziarsi. Il tessuto verrà quindi portato a un'interfaccia aria-liquido per promuovere la differenziazione.

Analisi istologica. I fogli di cellule epiteliali congiuntivali sulla membrana amniotica saranno esaminati mediante microscopia ottica. I campioni di tessuto saranno fissati e processati con l'uso di procedure istologiche standard e colorati con reagenti H&E e PAS. L'esame al microscopio elettronico sarà effettuato per il tessuto. Le sezioni saranno inoltre sottoposte ad analisi immunoistochimica per marcatori di citocheratina.

Trapianto clinico di cellule epiteliali congiuntivali coltivate su HAM

Preparazione di cellule congiuntivali coltivate su membrana amniotica Pazienti con vari disturbi della superficie oculare saranno selezionati per la prima serie di trapianti. Tutti i pazienti saranno sottoposti a consulenza completa per il consenso informato per le procedure. Una biopsia congiuntivale fornice sarà eseguita sull'occhio sano controlaterale. PI eseguirà i trapianti di foglio congiuntivale autologo cresciuto su membrana amniotica umana in questi pazienti. L'area malata verrà asportata utilizzando la tecnica chirurgica standard. Il difetto sarà coperto con il foglio di cellule congiuntivali in coltura sull'HAM con il lato epiteliale rivolto verso l'alto. L'innesto è fissato alla congiuntiva adiacente con suture vicryl 8/0 interrotte. Viene posizionata una lente a contatto per bendaggio planoterapeutico per proteggere il tessuto dal trauma palpebrale. Verranno somministrati giornalmente colliri topici di steroidi e antibiotici per ridurre l'infiammazione oculare. La sopravvivenza della congiuntiva sulla membrana amniotica sarà attentamente monitorata ei pazienti saranno seguiti a intervalli di 3 mesi fino a un anno. Durante queste visite, a questi pazienti verranno scattate fotografie del segmento anteriore e colorazione con fluoresceina per monitorare l'avanzamento della guarigione.

I trapianti possono essere eseguiti anche su pazienti selezionati con malattia della superficie oculare, ad esempio pemfigoide cicatriziale oculare, sindrome di Stevens Johnson e lesioni da alcali. Per queste gravi condizioni, questa procedura può rivelarsi un'importante aggiunta ad altre procedure, come il trapianto di cellule staminali limbari. Se lo studio iniziale avrà successo, sarà pianificato uno studio clinico randomizzato che confronterà questa procedura con l'autotrapianto congiuntivale convenzionale e il trapianto di membrana amniotica convenzionale. Pertanto, se ritenuto efficace, il trapianto di cellule congiuntivali in coltura su HAM può eventualmente essere utilizzato come procedura primaria o come procedura aggiuntiva per queste condizioni visivamente debilitanti.