Mateřský mikrochimerismus v lymfatických uzlinách kojenců s biliární atrézií v době operace Kasai (K-LNMC)

Při operaci kojenců s nesyndromatickou biliární atrézií (BA, nejběžnější forma) chirurgové téměř vždy zaznamenávají nápadný nález mnohočetných zduření lymfatických uzlin o velikosti až 2 cm v porta hepatis a mezenterii tenkého střeva, kde mohou tvořit hroznové víno. jako komplexy. Děti stejného věku laparotomizované pro jinou patologii běžně takové uzliny nemají.

Biliární atrézie je onemocnění novorozence, které je smrtelné, pokud se neléčí. Histologicky odpovídá degeneraci intra- a extrahepatálních žlučovodů v částečně specifickém zánětlivém infiltrátu a progresivní cirhóze.

Etiologie tohoto vzácného, ​​ale konstantního onemocnění (1:8-1:15 000) není známa. V současné době se v BA etiologickém výzkumu sledují dvě hlavní cesty:

1. Existuje podezření na virově indukované perinatální (auto)imunitní procesy. Experimentální forma BA může být vyprovokována infikováním myších matek dsRNA-viry, např. Rhesus-rotaviry nebo Reo-viry, zatímco u myší vakcinace matek zabránila experimentální BA. Význam dráhy y/5-T-buněk a IL17/IL23 pro BA je v současné době zkoumán. Avšak ve skupinách syngenních zvířat léčených stejnou šarží virů má BA tendenci být nekonstantní a je omezena na extrahepatální žlučovody, jako je otázka platnosti zvířecího modelu.
2. Druhý směr výzkumu se primárně nespoléhá na experimenty na novorozených zvířatech: Existují náznaky, že během těhotenství se placentární bariéra může stát propustnou pro mateřské lymfocyty (např. špatným umlčením chemokinů přitahujících T-buňky v buňkách deciduálního stromatu) a již v V játrech BA kojenců bylo prokázáno 2008 mateřských lymfocytů . Následně se fenomén mateřsko-fetálního mikrochimérismu dostal do centra pozornosti BA etiologického výzkumu: v kontextu smíšených mateřsko-fetálních imunitních reakcí by buňky mateřského původu mohly nesprávně nasměrovat nezralý imunitní systém kojence do autoimunity nebo působit přímo jako efektory v móda podobná štěpu vs.

Nedávno byl popsán význam mezenterických a portálních lymfatických uzlin pro dozrávání imunitního systému během těhotenství. Navíc bylo prokázáno, že tok mezi játry a portálními lymfatickými uzlinami je obousměrný. U myší bylo zjištěno, že frekvence CD4+ a FoxP3+ regulačních T-buněk souvisí s imunitním stavem matky. Předpokládali jsme tedy, že nápadně zduřelé lymfatické uzliny BA kojenců, se kterými se chirurgové neustále setkávají během Kasaiovy operace, mohou být klíčem k lepšímu pochopení patofyziologicky důležitých mechanismů transportu lymfocytů.

Při standardní operaci Kasai-operace, která má v závodě s narůstající jaterní cirhózou smysl do 4 měsíců věku, jsou resekovány degradované zbytky hlavních žlučovodů v jaterním hilu (tzv. „hilární ploténka“). , Roux y-smyčka se přišije na místo resekce. Musí odvádět případný tok žluči ze zbývajících žlučovodů. Dlouhodobá úspěšnost tohoto pokusného chirurgického řešení, které je středně technicky náročné a invazivní, se odhaduje na cca. 15-20 %. Ve zbývajících může částečný úspěch odložit nutnost transplantace jater. U sedmi po sobě jdoucích pacientek s histologicky prokázanou atrézií žlučových cest jsme zkoumali, zda v periportálních lymfatických uzlinách existuje důkaz pro mateřský gentický materiál.

metody:

Do studie bylo zařazeno 7 po sobě jdoucích pacientů s předoperační diagnózou BA. Jiné příčiny icterus prolongatus (deficit α1 anti-trypsinu, Alagilles syndrom, PFIC aj.) byly vyloučeny z technicky úspěšných metod ERCP (5/7 pacientů), které vykazovaly absenci intrahepatálních žlučovodů.

Po získání informovaného souhlasu rodičů byly matce a kojenci odebrány 2 ml EDTA plné krve. Během operace Kasai byly odebrány vzorky z jednoho portálu a jedné mezenteriální lymfatické uzliny (hlasování etické komise Hannover Medical School č. 1650/11.12.2012. Po bipolární disekci byly mezenterické mezery uzavřeny stehy 4-0 Vicryl.

Lymfatické uzliny byly rozrušeny mechanicky a DNA byla extrahována enzymaticky (QIAmp Kit, Qiagen, Hilden/Německo), jak bylo popsáno dříve, a normalizována na 30 ug/ml.

Analýza krátkého tandemového opakování byla provedena pomocí multiplexní PCR pro markery LIPOL, VWA, TH01, D19S253, CSF, PLA2A. FGA, D21S11, D18S51, jak je popsáno. Stručně, analýza délky fragmentu byla provedena na Abi Prism 310 System s GeneScan 3.11. software pro porovnání krve matky a dítěte s DNA lymfatických uzlin.

Genetické jednonukleotidové polymorfismy (SNP) byly sledovány kvantitativními analýzami chimerismu PCR v reálném čase. Reakce byly provedeny na platformě iCycler iQ5 PCR v reálném čase (Bio-Rad) s použitím ABsolute QPCR Rox Mix (Thermo science). Zakázkově navržené primery a sondy poskytla společnost Sigma-Aldrich. Kontrolní reakce a normalizace vzorku DNA byly provedeny amplifikací genu pro albumin.