Microquimerismo materno em gânglios linfáticos de bebês com atresia biliar no momento da operação de Kasai (K-LNMC)

Após a operação de lactentes com atresia biliar não sindrômica (BA, forma mais comum), os cirurgiões quase invariavelmente observam o achado proeminente de múltiplos linfonodos inchados de até 2 cm de tamanho na porta hepática e no mesentério do intestino delgado, onde podem constituir como complexos. Bebês da mesma idade laparotomizados por outra patologia comumente não apresentam esses linfonodos.

A atresia biliar é uma doença do recém-nascido que é fatal quando não tratada. Histologicamente corresponde a uma degeneração das vias biliares intra e extra hepáticas no interior de um infiltrado inflamatório em parte específico e cirrose progressiva.

A etiologia desta doença rara mas constante (1:8-1:15.000) é desconhecida. Atualmente, na pesquisa de etiologia da BA, dois caminhos principais são perseguidos:

1. Suspeita-se de processos perinatais (auto)imunes induzidos por vírus. Uma forma experimental de BA pode ser provocada pela infecção de mães murinas com vírus dsRNA, e. Rhesus-rotavírus ou Reo-vírus em camundongos, a vacinação das mães impediu BA experimental. A importância da via γ/δ-célula T e IL17/IL 23 para BA é atualmente investigada. No entanto, em grupos de animais singênicos tratados com o mesmo lote de vírus, a BA tende a ser inconstante e limitada a ductos biliares extra-hepáticos, o que questiona a validade do modelo animal.
2. A outra direção da pesquisa não depende principalmente de experimentos envolvendo animais recém-nascidos: há indícios de que durante a gravidez a barreira placentária pode se tornar permeável para linfócitos maternos (por exemplo, por um silenciamento defeituoso de quimiocinas que atraem células T em células do estroma decidual) e já em 2.008 linfócitos maternos foram demonstrados em fígados de bebês BA. Posteriormente, o fenômeno do microquimerismo materno-fetal tornou-se o foco da pesquisa de etiologia da AB: no contexto de reações imunes materno-fetais mistas, as células de origem materna podem direcionar erroneamente o sistema imunológico imaturo do bebê para a auto-imunidade ou atuar diretamente como efetores em um enxerto contra hospedeiro como moda.

A importância dos linfonodos mesentéricos e portais para a maturação do sistema imunológico durante a gravidez foi relatada recentemente. Além disso, foi demonstrado que o fluxo entre o fígado e os gânglios linfáticos portais é bidirecional. Em camundongos In, verificou-se que a frequência de células T regulatórias CD4+ e FoxP3+ estava ligada ao estado imunológico da mãe. Assim, levantamos a hipótese de que os gânglios linfáticos proeminentemente inchados de bebês com BA, que os cirurgiões encontram constantemente durante a operação de Kasai, podem ser a chave para a melhor compreensão dos importantes mecanismos fisiopatológicos do tráfico de linfócitos.

Na operação padrão, a operação de Kasai, que em uma corrida com cirrose hepática crescente faz sentido até a idade de 4 meses, os restos degradados dos principais ductos biliares no hilo hepático (a chamada "placa hilar") são ressecados , Uma alça em Y de Roux é suturada no local da ressecção. Ele deve drenar qualquer fluxo biliar contingente dos ductos biliares remanescentes. A taxa de sucesso a longo prazo desta tentativa de cura cirúrgica, de moderada complexidade técnica e invasividade, é estimada em ca. 15-20%. No restante, um sucesso parcial pode adiar a necessidade de transplante de fígado. Examinamos em sete pacientes consecutivos com atresia biliar comprovada histologicamente se nos linfonodos periportais havia evidência de material genético materno.

Métodos :

7 pacientes consecutivos com diagnóstico pré-operatório de AB foram incluídos no estudo. Outras causas de icterícia prolongada (deficiência de α1 antitripsina, síndrome de Alagilles, PFIC etc.) foram excluídas entre os métodos de CPRE bem-sucedidos (5/7 pacientes) que mostraram ausência de ductos biliares intra-hepáticos.

Depois de obter o consentimento informado dos pais, 2 ml de sangue total com EDTA foram coletados da mãe e do bebê. Durante a operação de Kasai, um portal e um linfonodo mesentérico foram amostrados (voto do comitê de ética da Escola de Medicina de Hannover No.1650/11.12.2012. Após dissecção bipolar, as lacunas mesentéricas foram fechadas com sutura Vicryl 4-0.

Os linfonodos foram rompidos mecanicamente e o DNA foi extraído enzimaticamente (QIAmp Kit, Qiagen, Hilden/Alemanha) conforme descrito anteriormente e normalizado para 30 ug/ml.

A análise de repetição curta em tandem foi realizada com PCR multiplex para marcadores LIPOL, VWA, TH01, D19S253, CSF, PLA2A. FGA, D21S11, D18S51 conforme descrito. Resumidamente, a análise do comprimento do fragmento foi realizada em um sistema Abi Prism 310 com GeneScan 3.11. software para comparação do sangue da mãe e do bebê com o DNA do linfonodo.

Polimorfismos genéticos de nucleotídeo único (SNPs) foram rastreados por análises quantitativas de quimerismo de PCR em tempo real. As reações foram executadas em uma plataforma de PCR em tempo real iCycler iQ5 (Bio-Rad) usando o ABsolute QPCR Rox Mix (Thermo Scientific). Os primers e sondas personalizados foram fornecidos pela Sigma-Aldrich. As reações de controle e normalização do DNA da amostra foram realizadas pela amplificação do gene da albumina.