Mikrochimeryzm matki w węzłach chłonnych niemowląt z atrezją dróg żółciowych w czasie operacji Kasai (K-LNMC)

Podczas operacji niemowląt z niesyndromatyczną atrezją dróg żółciowych (BA, najczęstsza postać) chirurdzy prawie zawsze zauważają wyraźne stwierdzenie wielu obrzękniętych węzłów chłonnych o wielkości do 2 cm w porta hepatis i krezce jelita cienkiego, gdzie mogą stanowić winogrona jak kompleksy. Niemowlęta w tym samym wieku po laparotomii z powodu innej patologii zwykle nie mają takich węzłów.

Atrezja dróg żółciowych jest chorobą noworodków, która nieleczona jest śmiertelna. Histologicznie odpowiada to zwyrodnieniu wewnątrz- i zewnątrzwątrobowych dróg żółciowych w obrębie częściowo swoistego nacieku zapalnego i postępującej marskości wątroby.

Etiologia tej rzadkiej, ale stale występującej choroby (1:8-1:15 000) jest nieznana. Obecnie w badaniach etiologii BA realizowane są dwie główne ścieżki:

1. Podejrzewa się okołoporodowe procesy (auto)immunologiczne wywołane przez wirusy. Eksperymentalną postać BA można sprowokować przez zarażenie mysich matek wirusami dsRNA, np. Rhesus-rotaviruses lub Reo-viruses u myszy, szczepienie matek zapobiegło eksperymentalnemu BA. Znaczenie limfocytów T γ/δ i szlaku IL17/IL23 dla BA jest obecnie badane. Jednak w grupach zwierząt syngenicznych leczonych tą samą partią wirusów BA ma tendencję do bycia niestałym i ogranicza się do pozawątrobowych dróg żółciowych, na przykład kwestia ważności modelu zwierzęcego jest problemem.
2. Drugi kierunek badań nie opiera się przede wszystkim na eksperymentach z udziałem noworodków: istnieją przesłanki, że w czasie ciąży bariera łożyskowa może stać się przepuszczalna dla matczynych limfocytów (np. Limfocyty matczyne 2008 wykazano w wątrobie niemowląt BA. Następnie zjawisko mikrochimeryzmu matczyno-płodowego znalazło się w centrum zainteresowania badań etiologicznych BA: w kontekście mieszanych matczyno-płodowych reakcji immunologicznych komórki pochodzenia matczynego mogą błędnie skierować niedojrzały układ odpornościowy niemowlęcia na autoimmunizację lub działać bezpośrednio jako efektory w przeszczep przeciwko gospodarzowi, jak moda.

Ostatnio doniesiono o znaczeniu krezkowych i wrotnych węzłów chłonnych dla dojrzewania układu odpornościowego w czasie ciąży. Ponadto wykazano, że przepływ między wątrobą a węzłami chłonnymi wrotnymi jest dwukierunkowy. U myszy stwierdzono, że częstość występowania limfocytów T regulatorowych CD4+ i FoxP3+ jest powiązana ze statusem odpornościowym matki. W związku z tym postawiliśmy hipotezę, że wyraźnie spuchnięte węzły chłonne niemowląt z BA, które chirurdzy stale napotykają podczas operacji Kasai, mogą stanowić klucz do lepszego zrozumienia patofizjologicznych ważnych mechanizmów transportu limfocytów.

W standardowej operacji, operacji Kasai, która w rasie z narastającą marskością wątroby ma sens do 4 miesiąca życia, wycina się zdegradowane resztki głównych dróg żółciowych we wnęce wątroby (tzw. , Do miejsca resekcji przyszyto pętlę Y Roux. Odprowadza ewentualny wypływ żółci z pozostałych dróg żółciowych. Długoterminowy wskaźnik powodzenia tej wstępnej metody leczenia chirurgicznego, która charakteryzuje się umiarkowaną złożonością techniczną i inwazyjnością, szacuje się na ok. 15-20%. W pozostałych częściowy sukces może odsunąć w czasie konieczność przeszczepienia wątroby. U siedmiu kolejnych pacjentów z potwierdzoną histologicznie atrezją dróg żółciowych zbadaliśmy, czy w okołowrotnych węzłach chłonnych były dowody na obecność matczynego materiału genetycznego.

Metody:

Do badania włączono 7 kolejnych pacjentów z przedoperacyjnym rozpoznaniem BA. Inne przyczyny icterus prolongatus (niedobór α1 anty-trypsyny, zespół Alagillesa, PFIC itp.) zostały wykluczone z metod technicznych udanej ERCP (5/7 pacjentów), która wykazała brak wewnątrzwątrobowych dróg żółciowych.

Po uzyskaniu świadomej zgody rodziców pobrano od matki i niemowlęcia 2 ml krwi pełnej EDTA. Podczas operacji Kasai pobrano próbkę z jednego portalu i jednego węzła chłonnego krezki (głosowanie komisji etycznej Szkoły Medycznej w Hanowerze nr 1650/11.12.2012. Po dyssekcji bipolarnej szczeliny krezkowe zamknięto szwami Vicryl 4-0.

Węzły chłonne rozerwano mechanicznie i DNA wyekstrahowano enzymatycznie (zestaw QIAmp, Qiagen, Hilden/Niemcy), jak opisano wcześniej i znormalizowano do 30 μg/ml.

Analizę krótkich powtórzeń tandemowych przeprowadzono metodą multipleksowego PCR dla markerów LIPOL, VWA, TH01, D19S253, CSF, PLA2A. FGA, D21S11, D18S51 zgodnie z opisem. Pokrótce, analizę długości fragmentów przeprowadzono w systemie Abi Prism 310 z programem GeneScan 3.11. oprogramowanie do porównywania krwi matki i dziecka z DNA węzłów chłonnych.

Genetyczne polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP) śledzono za pomocą ilościowych analiz chimeryzmu PCR w czasie rzeczywistym. Reakcje przeprowadzono na platformie PCR w czasie rzeczywistym iCycler iQ5 (Bio-Rad) przy użyciu ABsolute QPCR Rox Mix (Thermo science). Specjalnie zaprojektowane startery i sondy dostarczyła firma Sigma-Aldrich. Reakcje kontrolne i normalizację próbki DNA przeprowadzono przez amplifikację genu albuminy.