Fenotypová a genotypová charakterizace subjektů se syndromovou obezitou: identifikace nových kandidátských genů pomocí sekvenování exomu (OBEXOME) (OBEXOME)

Sekvenování exonů:

Dosud nebyla většina syndromických obezit objasněna. Nedostatek identifikace příslušných molekulárních abnormalit však omezuje informace pro rodiny o riziku recidivy a optimální podporu pacienta.

Nový nástroj molekulární biologie nazvaný sekvenování exonů ("exom") nebo cílené sekvenování podmnožiny genomu, který kóduje proteiny, ukázal svou schopnost identifikovat mutace zodpovědné za vzácná onemocnění, u malého počtu jedinců dosáhli nesouvisejících. Tento nástroj skutečně pomohl identifikovat dvě mutace v genu TSPAN12 (tetraspanin 12) u 23 pacientů s exsudativní vitreoretinopatií, 3 mutacemi v genu PRRT2 (transmembránový protein bohatý na prolin 2) v 8 čínských rodinách s kinesigenní paroxysmální dyskinezí, 2 nesmyslné mutace v genu ANGPTL3 (angiopoietin-like 3) u 2 jedinců s familiární kombinovanou hypolipidemií, mutací genu RBM10 (RNA binding motiv 10) u 3 pacientů se syndromickou formou rozštěpu patra (TARP syndrom) nebo mutací rozštěpu genu PALB2 (partner a lokalizátor BRCA2) u pacienta s rakovinou pankreatu. Výzkumníci se domnívají, že tento nástroj by mohl identifikovat nové molekulární abnormality u jedinců se syndromickou obezitou. Podrobná analýza fenotypových dat by mohla identifikovat skupinu obézních pacientů (alespoň 10) sdílejících klinický a biologický fenotyp, u kterých by byla tato technika použita.

Sekvenování exomu bude provedeno u subjektů vybraných z jejich fenotypu, ale také mezi jejich příbuznými (2 rodiče a sourozenec), aby byla zajištěna další rozlišovací schopnost. Každá nová varianta nalezená v homozygotním stavu u obézních pacientů a nepostižených příbuzných bude okamžitě vyřazena ze seznamu kandidátních mutací. Naopak jakákoli varianta nalezená u pacientů, ale nepřítomná u rodičů i sourozenců, je potenciální de novo mutací. Přítomnost jakékoli varianty kandidáta bude hledána v různých exomových veřejných databázích (dbSNP, 1000 Genomes, Exome Variant Server) a v případě neuvedené varianty bude možné genotypovat v kohortách dětí s běžnou obezitou a bez -obézní za účelem zjištění její frekvence a poskytnutí dalších informací o jejím potenciálním zapojení do fenotypu syndromické obezity. Posledním krokem, který ověří roli variantního genu v klinickém obrazu, bude in vitro analýza funkčních důsledků na protein a následně in vivo na zvířecích modelech.

Sekvenování všech exonů („exomů“) 40 vybraných subjektů (10 probandů s oběma rodiči a neobézním sourozencem) bude provedeno na genomové platformě pomocí nového typu generačního sekvenátoru Illumina HiSeq 2000. K tomu bude potřeba DNA 3 μg (15 μl koncentrace až 200 ng/ul) na vzorek s následným sekvenováním typu „paired-end“ na 2 x 75 bp. Vygenerované sekvence budou zarovnány s referenčním genomem (sestavení hg19) pomocí softwaru BWA. Duplikáty (duplikáty PCR a „optické duplikáty“) budou eliminovány jako nespárované a nesprávně zarovnané sekvence (Q-skóre <20). Vygenerované sekvence pak budou rekalibrovány softwarem GATK, aby se zlepšila detekce inzerce/delece takových variací. Detekce variant bude provedena pomocí softwaru nástrojů a anotace bude pomocí softwaru annovar. Rozbory se zaměří na detekované varianty s hloubkou minimálně 10x. Vyšetřovatelé vyberou jakoukoli variantu nalezenou v homozygotním stavu u pacienta a v heterozygotním stavu s jeho rodiči (recesivní hypotéza). Varianty, které budou mezi nepostiženými příbuznými rovněž homozygotní, budou ze seznamu kandidátů vyloučeny. Jakákoli varianta nalezená u pacientů, ale nepřítomná u obou rodičů, může být také potenciálním kandidátem v případě de novo Výzkumníci se domnívají, že tato strategie by mohla usnadnit diagnostiku, ale také, po ověření role této varianty v patologii, posoudit riziko recidivy rodinám tím, že v případě potřeby nabídne prenatální diagnostiku. Těmto dětem také poskytne co nejdříve podporu, jako je lékařská, psychologická a sociální péče o děti s Prader-Williho syndromem. Existence genetické diagnózy zodpovědné za fenotyp totiž umožňuje vyvinout specifický životní projekt přizpůsobený pacientovi a usnadňuje rozvojovou pomoc pro postižení prostřednictvím referenčních center a spolupráce s domovy zdravotně postižených (MDPH) na odděleních. Konečně pokrok v pochopení mechanismů těchto obezity může pomoci lépe porozumět patofyziologii nejběžnějších forem obezity a zlepšit léčbu.

Výběr pacienta:

U dětí a dospělých se syndromickou obezitou je v běžné péči systematicky plánována denní hospitalizace za účelem provedení kompletního klinického a biologického vyšetření. Informace o různých vyšetřeních provedených během dne hospitalizace jsou uvedeny při konzultaci. Bude navržena genetická studie Byla navržena během této konzultace pacientům, dětem a dospělým a jejich rodinám. Termín hospitalizace je zpravidla v měsíci následujícím po konzultaci.

Zařazení - denní hospitalizace pacienta:

V rámci běžné péče je vyšetřovatelem prováděna přesná fenotypová charakterizace: rodinná hmotnostní anamnéza, retrospektivní analýza osobní hmotnostní anamnézy, klinické vyšetření, antropometrie, dietní konzultace, měření tělesného složení a výdej energie na odpočinek, jídlo a dotazníky fyzické aktivity, endokrinní a metabolické vyvážené.

Výzkum bude sestávat ze vzorku krve o 20 ml navíc pro genetickou studii a bude proveden u obézních subjektů po podepsání souhlasu. Pacienti, u kterých jsou analyzovatelné vzorky již uloženy v bance DNA č. DC2009-957, nebudou znovu odebrány.