Фенотипическая и генотипическая характеристика субъектов с синдромальным ожирением: идентификация новых генов-кандидатов с помощью секвенирования экзома (OBEXOME) (OBEXOME)

Секвенирование экзонов:

На сегодняшний день большая часть синдромального ожирения не выяснена. Но отсутствие идентификации вовлеченных молекулярных аномалий ограничивает информацию семьям о риске рецидива и оптимальной поддержке пациента.

Новый инструмент молекулярной биологии, называемый секвенированием экзонов («экзом») или целевым секвенированием подмножества генома, кодирующего белки, продемонстрировал свою способность выявлять мутации, ответственные за редкие заболевания, у небольшого числа людей, не являющихся родственниками. Действительно, этот инструмент помог выявить две мутации в гене TSPAN12 (тетраспанин 12) у 23 человек с экссудативной витреоретинопатией, 3 мутации в гене PRRT2 (богатый пролином трансмембранный белок 2) в 8 китайских семьях с кинезигенной пароксизмальной дискинезией, 2 нонсенс-мутации в гене ANGPTL3 (ангиопоэтиноподобный 3) у 2 пациентов с семейной комбинированной гиполипидемией, мутация гена RBM10 (РНК-связывающий мотив 10) у 3 пациентов с синдромальной формой расщелины неба (TARP-синдром) или мутация ген PALB2 (партнер и локализатор BRCA2) у больного раком поджелудочной железы. Исследователи считают, что этот инструмент может выявить новые молекулярные аномалии у людей с синдромальным ожирением. Детальный анализ фенотипических данных может выявить группу пациентов с ожирением (не менее 10), имеющих одинаковый клинический и биологический фенотип и у которых будет использоваться этот метод.

Секвенирование экзома будет проводиться у субъектов, отобранных по их фенотипу, а также среди их родственников (2 родителей и брат или сестра), чтобы обеспечить дополнительную способность к различению. Каждый новый вариант, обнаруженный в гомозиготном состоянии у пациентов с ожирением и здоровых родственников, будет немедленно исключен из списка мутаций-кандидатов. И наоборот, любой вариант, обнаруженный у пациентов, но отсутствующий у обоих родителей и братьев и сестер, является потенциальной мутацией de novo. Присутствие любого вариантного кандидата будет искаться в различных общедоступных базах данных экзома (dbSNP, 1000 Genomes, Exome Variant Server), и, в случае незарегистрированного варианта, будет возможно генотипирование в когортах детей с обычным ожирением и не -ожирение, чтобы определить его частоту и, таким образом, предоставить дополнительную информацию о его потенциальном участии в фенотипе синдромального ожирения. Последним шагом, который подтвердит роль вариантного гена в клинической картине, будет анализ in vitro функциональных последствий для белка, а затем in vivo на животных моделях.

Секвенирование всех экзонов («экзомов») 40 выбранных субъектов (10 пробандов с обоими родителями и братьями и сестрами без ожирения) будет выполняться на геномной платформе с использованием секвенатора нового типа Illumina HiSeq 2000. Для этого потребуется 3 мкг ДНК (концентрация от 15 мкл до 200 нг/мкл) на образец с последующим секвенированием типа «парный конец» на 2 x 75 п.н. Сгенерированные последовательности будут сопоставлены с эталонным геномом (сборка hg19) с помощью программного обеспечения BWA. Дубликаты (дупликаты ПЦР и оптические дубликаты) будут исключены как непарные и неправильно выровненные последовательности (оценка Q <20). Затем сгенерированные последовательности будут повторно откалиброваны программным обеспечением GATK для улучшения обнаружения вставки/удаления таких вариаций. Обнаружение вариантов будет выполняться с использованием программного обеспечения инструментов, а для аннотирования будет использоваться программное обеспечение annovar. Анализы будут сосредоточены на обнаруженных вариантах с глубиной не менее 10x. Исследователи отберут любой вариант, обнаруженный в гомозиготном состоянии у больного и в гетерозиготном состоянии у его родителей (рецессивная гипотеза). Варианты, также обнаруженные гомозиготными среди здоровых родственников, будут исключены из списка кандидатов. Любой вариант, обнаруженный у пациентов, но отсутствующий у обоих родителей, также может быть потенциальным кандидатом в случае de novo. Исследователи считают, что эта стратегия может облегчить диагностику, но также, после подтверждения роли этого варианта в патологии, оценить риск рецидива семьям, предлагая при необходимости пренатальную диагностику. Он также окажет поддержку этим детям как можно раньше, например, медицинскую, психологическую и социальную помощь детям с синдромом Прадера-Вилли. Действительно, наличие генетического диагноза, отвечающего за фенотип, позволяет разработать конкретный жизненный проект, адаптированный к пациенту, и облегчает развитие помощи при инвалидности через референс-центры и сотрудничество с ведомственными домами инвалидов (МДИН). Наконец, прогресс в понимании механизмов этого ожирения может помочь лучше понять патофизиологию наиболее распространенных форм ожирения и улучшить лечение.

Выбор пациента:

Для детей и взрослых с синдромальным ожирением систематически планируется дневная госпитализация в обычном режиме для проведения полной клинической и биологической оценки. Информация о различных обследованиях, проведенных в день госпитализации, предоставляется на консультации. Генетическое исследование будет предложено Во время этой консультации пациентам, детям и взрослым, и их семьям было предложено. Дата госпитализации обычно наступает через месяц после консультации.

Включение - дневная госпитализация:

В рамках обычного ухода исследователь проводит точную фенотипическую характеристику в день госпитализации: семейный анамнез веса, ретроспективный анализ индивидуального анамнеза веса, клиническое обследование, антропометрия, консультация по диете, измерение состава тела и расхода энергии на отдых, питание и опросники физической активности, эндокринно-метаболически сбалансированные.

Исследование будет состоять из дополнительных 20 мл образца крови для генетического исследования и будет проводиться у лиц с ожирением после подписания согласия. Пациенты, у которых анализируемые образцы уже хранятся в банке ДНК № DC2009-957, не будут взяты повторно.