Charakterystyka fenotypowa i genotypowa osób z otyłością syndromiczną: identyfikacja nowych genów kandydujących przez sekwencjonowanie egzomu (OBEXOME) (OBEXOME)

Sekwencjonowanie egzonów:

Do tej pory większość syndromicznych otyłości nie została wyjaśniona. Jednak brak identyfikacji występujących nieprawidłowości molekularnych ogranicza informowanie rodzin o ryzyku nawrotu i optymalnym wsparciu pacjenta.

Nowe narzędzie biologii molekularnej, zwane sekwencjonowaniem eksonów („egzom”) lub ukierunkowanym sekwencjonowaniem podzbioru genomu, który koduje białka, wykazało swoją moc identyfikowania mutacji odpowiedzialnych za rzadkie choroby u niewielkiej liczby osobników, które nie były ze sobą powiązane. Rzeczywiście, to narzędzie pomogło zidentyfikować dwie mutacje w genie TSPAN12 (Tetraspanin 12) u 23 pacjentów z wysiękową retinopatią witreo, 3 mutacje w genie PRRT2 (białko transbłonowe bogate w prolinę 2) w 8 chińskich rodzinach z kinezygenną napadową dyskinezą, 2 nonsensowne mutacje w genie ANGPTL3 (angiopoetynopodobny 3) u 2 osób z rodzinną mieszaną hipolipidemią, mutacja genu RBM10 (motyw wiążący RNA 10) u 3 pacjentów z syndromiczną postacią rozszczepu podniebienia (zespół TARP) lub mutacja genu PALB2 (partnera i lokalizatora BRCA2) u pacjenta z rakiem trzustki. Badacze uważają, że to narzędzie może zidentyfikować nowe nieprawidłowości molekularne u osób z otyłością syndromiczną. Szczegółowa analiza danych fenotypowych mogłaby zidentyfikować grupę otyłych pacjentów (co najmniej 10) o wspólnym fenotypie klinicznym i biologicznym, w której ta technika byłaby stosowana.

Sekwencjonowanie egzomu zostanie przeprowadzone u osób wybranych na podstawie ich fenotypu, ale także wśród ich krewnych (2 rodziców i rodzeństwo), aby zapewnić dodatkową zdolność dyskryminacyjną. Każdy nowy wariant znaleziony w stanie homozygotycznym u otyłych pacjentów i zdrowych krewnych zostanie natychmiast wykluczony z listy potencjalnych mutacji. I odwrotnie, każdy wariant znaleziony u pacjentów, ale nieobecny u obojga rodziców i rodzeństwa, jest potencjalną mutacją de novo. Obecność dowolnego kandydata na wariant będzie poszukiwana w różnych publicznych bazach danych egzomu (dbSNP, 1000 Genomes, Exome Variant Server), a w przypadku wariantu nienotowanego na liście możliwe będzie genotypowanie w kohortach dzieci z otyłością powszechną i -otyłych w celu określenia jego częstości, a tym samym dostarczenia dodatkowych informacji o jego potencjalnym zaangażowaniu w fenotyp syndromicznej otyłości. Ostatnim krokiem, który potwierdzi rolę wariantu genu w obrazie klinicznym, będzie analiza in vitro konsekwencji funkcjonalnych dla białka, a następnie in vivo na modelach zwierzęcych.

Sekwencjonowanie wszystkich eksonów („eksomów”) 40 wybranych osobników (10 probantów z obojgiem rodziców i nieotyłym rodzeństwem) zostanie przeprowadzone na platformie genomowej przy użyciu sekwencera nowej generacji Illumina HiSeq 2000. Aby to zrobić, potrzebne będzie 3 μg DNA (stężenie 15 μl do 200 ng/μl) na próbkę, a następnie sekwencjonowanie typu "sparowany koniec" na 2 x 75 bp. Wygenerowane sekwencje zostaną dopasowane do genomu odniesienia (kompilacja hg19) przy użyciu oprogramowania BWA. Duplikaty (duplikaty PCR i duplikaty optyczne) zostaną wyeliminowane jako niesparowane i źle wyrównane sekwencje (Q-score <20). Wygenerowane sekwencje zostaną następnie ponownie skalibrowane przez oprogramowanie GATK, aby poprawić wykrywanie takich zmian typu insercja/delecja. Wykrywanie wariantów zostanie przeprowadzone przy użyciu oprogramowania narzędziowego, a adnotacja zostanie wykorzystana przy użyciu oprogramowania annovar. Analizy skupią się na wykrytych wariantach o głębokości co najmniej 10x. Badacze wybiorą każdy wariant znaleziony w stanie homozygotycznym u pacjenta iw stanie heterozygotycznym u jego rodziców (hipoteza recesywna). Warianty, które również zostaną uznane za homozygotyczne wśród zdrowych krewnych, zostaną wykluczone z listy kandydatów. Każdy wariant stwierdzony u pacjentów, ale nieobecny u obojga rodziców, może również być potencjalnym kandydatem w przypadku de novo. Badacze uważają, że taka strategia może ułatwić diagnozę, ale także, po walidacji roli tego wariantu w patologii, ocenić ryzyko nawrotu dla rodziny, oferując w razie potrzeby diagnostykę prenatalną. Zapewni również jak najwcześniejsze wsparcie dla tych dzieci, takie jak opieka medyczna, psychologiczna i społeczna nad dziećmi z zespołem Pradera-Williego. Istotnie, istnienie genetycznej diagnozy odpowiedzialnej za fenotyp pozwala na opracowanie konkretnego projektu życiowego dostosowanego do pacjenta i ułatwia pomoc rozwojową dla osób niepełnosprawnych poprzez ośrodki referencyjne i współpracę z oddziałowymi domami osób niepełnosprawnych (MDPH). Wreszcie postęp w zrozumieniu mechanizmów tej otyłości może pomóc w lepszym zrozumieniu patofizjologii najczęstszych postaci otyłości i usprawnieniu leczenia.

Wybór pacjenta:

W przypadku dzieci i dorosłych z zespołem otyłości planowana jest jednodniowa hospitalizacja w ramach zwykłej opieki w celu przeprowadzenia pełnej oceny klinicznej i biologicznej. Podczas konsultacji udzielane są informacje na temat poszczególnych badań wykonywanych w ciągu dnia hospitalizacji. Zostanie zaproponowane badanie genetyczne Zaproponowano podczas tej konsultacji pacjentom, dzieciom i dorosłym oraz ich rodzinom. Termin hospitalizacji przypada zwykle w miesiącu następującym po konsultacji.

Włączenie - hospitalizacja dzienna pacjenta:

W ramach zwykłej opieki badacz dokonuje dokładnej charakterystyki fenotypowej podczas hospitalizacji dziennej: wywiadu masy ciała w rodzinie, retrospektywnej analizy historii masy ciała, badania klinicznego, antropometrii, konsultacji dietetycznej, pomiarów składu ciała i wydatku energetycznego spoczynku, pożywienia i kwestionariusze aktywności fizycznej, zrównoważone hormonalnie i metabolicznie.

Badanie będzie polegało na pobraniu dodatkowej próbki krwi 20 ml do badania genetycznego i zostanie przeprowadzone u osób otyłych po podpisaniu zgody. Pacjenci, od których próbki nadające się do analizy są już przechowywane w banku DNA nr DC2009-957, nie zostaną ponownie pobrane.