Caracterização Fenotípica e Genotípica de Indivíduos com Obesidade Sindrômica: Identificando Novos Genes Candidatos por Sequenciamento do Exoma (OBEXOME) (OBEXOME)

Sequenciamento de éxons:

Até o momento, a maioria das obesidades sindrômicas não foi elucidada. Porém, a falta de identificação das anormalidades moleculares envolvidas limita as informações às famílias sobre o risco de recorrência e o suporte ideal ao paciente.

Uma nova ferramenta de biologia molecular chamada sequenciamento de éxons ("exoma") ou subconjunto de sequenciamento direcionado do genoma que codifica proteínas mostrou seu poder de identificar mutações responsáveis ​​por doenças raras, em um pequeno número de indivíduos não relacionados. Com efeito, esta ferramenta ajudou a identificar duas mutações no gene TSPAN12 (Tetraspanina 12) em 23 indivíduos com vitreorretinopatia exsudativa, 3 mutações no gene PRRT2 (proline-rich transmembrane protein 2) em 8 famílias chinesas com discinesia paroxística cinesigênica, 2 mutações sem sentido no gene ANGPTL3 (angiopoietina-like 3) em 2 indivíduos com hipolipidemia familiar combinada, uma mutação do gene RBM10 (RNA binding motif 10) em 3 pacientes com forma sindrômica de fenda palatina (síndrome TARP) ou uma mutação da gene PALB2 (parceiro e localizador de BRCA2) em paciente com câncer pancreático. Os pesquisadores acreditam que esta ferramenta pode identificar novas anormalidades moleculares em indivíduos com obesidade sindrômica. A análise detalhada dos dados fenotípicos poderia identificar um grupo de pacientes obesos (pelo menos 10) compartilhando fenótipo clínico e biológico e no qual esta técnica seria utilizada.

O sequenciamento do exoma será realizado em indivíduos selecionados a partir de seu fenótipo, mas também entre seus parentes (2 pais e um irmão) para fornecer capacidade discriminativa adicional. Cada nova variante encontrada no estado homozigoto em pacientes obesos e parentes não afetados será imediatamente excluída da lista de mutações candidatas. Por outro lado, qualquer variante encontrada em pacientes, mas ausente em ambos os pais e irmãos, é uma potencial mutação de novo. A presença de qualquer variante candidata será pesquisada nas diferentes bases de dados públicas de exoma (dbSNP, 1000 Genomes, Exome Variant Server) e, no caso de uma variante não listada, será possível genotipar em coortes de crianças com obesidade comum e não -obeso, a fim de determinar sua frequência e, assim, fornecer informações adicionais sobre seu envolvimento potencial no fenótipo da obesidade sindrômica. A última etapa que validará o papel do gene variante no quadro clínico será a análise in vitro das consequências funcionais na proteína e depois in vivo em modelos animais.

O sequenciamento de todos os éxons ("exomas") dos 40 indivíduos selecionados (10 probandos com ambos os pais e irmãos não obesos) será realizado em plataforma genômica usando um novo tipo de sequenciador de geração Illumina HiSeq 2000. Para isso, serão necessários 3μg de DNA (concentração de 15μL a 200 ng/uL) por amostra com sequenciamento do tipo "pared-end" em 2 x 75bp. As sequências geradas serão alinhadas com o genoma de referência (build hg19) utilizando o Software BWA. Duplicatas (duplicatas de PCR' e 'duplicatas ópticas') serão eliminadas como sequências não pareadas e desalinhadas (Q-score <20). As sequências geradas serão então recalibradas pelo software GATK para melhorar a detecção de tais variações de inserção/exclusão. A detecção de variantes será realizada usando o software de ferramentas e a anotação usará o software annovar. As análises se concentrarão nas variantes detectadas com uma profundidade de pelo menos 10x. Os investigadores selecionarão qualquer variante encontrada no estado homozigoto no paciente e no estado heterozigoto com seus pais (hipótese recessiva). As variantes também consideradas homozigóticas entre os parentes não afetados serão excluídas da lista de candidatos. Qualquer variante encontrada em pacientes, mas ausente em ambos os pais, também pode ser uma potencial candidata no caso de novo famílias, oferecendo diagnóstico pré-natal, se necessário. Também proporcionará um apoio o mais precoce possível a essas crianças, como o atendimento médico, psicológico e social de crianças com síndrome de Prader-Willi. Com efeito, a existência de um diagnóstico genético responsável pelo fenótipo permite o desenvolvimento de um projeto de vida específico adaptado ao paciente e facilita a ajuda ao desenvolvimento da deficiência através dos centros de referência e colaboração com lares departamentais de pessoas com deficiência (MDPH). Finalmente, o progresso na compreensão dos mecanismos dessas obesidades pode ajudar a entender melhor a fisiopatologia das formas mais comuns de obesidade e melhorar o manejo.

Seleção do paciente:

Para crianças e adultos com obesidade sindrômica, a hospitalização diurna é sistematicamente planejada nos cuidados habituais para realizar uma avaliação clínica e biológica completa. As informações sobre os diversos exames realizados no dia da internação são dadas em consulta. O estudo genético será proposto Foi proposto nesta consulta aos pacientes, crianças e adultos, e seus familiares. A data de internação costuma ser no mês seguinte à consulta.

Inclusão - hospitalização do dia do paciente:

Como parte dos cuidados habituais, uma caracterização fenotípica precisa é realizada pelo investigador hospitalização-dia: histórico de peso familiar, análise retrospectiva do histórico de peso pessoal, exame clínico, antropometria, consulta dietética, medidas de composição corporal e gasto energético de repouso, alimentação e questionários de atividade física, equilíbrio endócrino e metabólico.

A pesquisa consistirá em uma amostra de sangue de 20 mL extra para o estudo genético e será realizada em indivíduos obesos após assinatura de termo de consentimento. Os pacientes para os quais as amostras analisáveis ​​já estão armazenadas no banco de DNA No. DC2009-957 não serão amostrados novamente.