Caratterizzazione fenotipica e genotipica di soggetti con obesità sindromica: identificazione di nuovi geni candidati mediante sequenziamento dell'esoma (OBEXOME) (OBEXOME)

Sequenziamento degli esoni:

Ad oggi, la maggior parte delle obesità sindromiche non è stata chiarita. Tuttavia, la mancanza di identificazione delle anomalie molecolari coinvolte limita le informazioni alle famiglie sul rischio di recidiva e sul supporto ottimale del paziente.

Un nuovo strumento di biologia molecolare chiamato sequenziamento di esoni ("esoma") o sottoinsieme di sequenziamento mirato del genoma che codifica per le proteine ​​ha mostrato il suo potere di identificare le mutazioni responsabili di malattie rare, in un piccolo numero di individui raggiunti non imparentati. Infatti, questo strumento ha aiutato a identificare due mutazioni nel gene TSPAN12 (Tetraspanin 12) in 23 soggetti con vitreo-retinopatia essudativa, 3 mutazioni nel gene PRRT2 (proline-rich transmembrane protein 2) in 8 famiglie cinesi con discinesia parossistica chinesigenica, 2 mutazioni nonsense nel gene ANGPTL3 (angiopoietin-like 3) in 2 soggetti con ipolipidemia familiare combinata, una mutazione del gene RBM10 (RNA binding motif 10) in 3 pazienti con forma sindromica di palatoschisi (sindrome TARP) o una mutazione del gene PALB2 (partner e localizzatore di BRCA2) in un paziente con carcinoma pancreatico. I ricercatori ritengono che questo strumento potrebbe identificare nuove anomalie molecolari negli individui con obesità sindromica. L'analisi dettagliata dei dati fenotipici potrebbe identificare un gruppo di pazienti obesi (almeno 10) che condividono fenotipo clinico e biologico e in cui questa tecnica verrebbe utilizzata.

Il sequenziamento dell'esoma sarà condotto in soggetti selezionati dal loro fenotipo ma anche tra i loro parenti (2 genitori e un fratello) per fornire ulteriore capacità discriminativa. Ogni nuova variante trovata allo stato omozigote in pazienti obesi e parenti non affetti verrà immediatamente esclusa dall'elenco delle mutazioni candidate. Al contrario, qualsiasi variante trovata nei pazienti ma assente sia nei genitori che nei fratelli è una potenziale mutazione de novo. La presenza di qualsiasi variante candidata sarà ricercata nei diversi database pubblici dell'esoma (dbSNP, 1000 Genomes, Exome Variant Server) e, nel caso di una variante non elencata, sarà possibile genotipizzare in coorti di bambini con obesità comune e non -obesi al fine di determinarne la frequenza e quindi fornire ulteriori informazioni sul suo potenziale coinvolgimento nel fenotipo dell'obesità sindromica. L'ultimo passo che convaliderà il ruolo del gene variante nel quadro clinico sarà l'analisi in vitro delle conseguenze funzionali sulla proteina e poi in vivo in un modello animale.

Il sequenziamento di tutti gli esoni ("esomi") dei 40 soggetti selezionati (10 probandi con genitori e fratelli non obesi) sarà eseguito su piattaforma genomica utilizzando un nuovo tipo di sequenziatore di generazione Illumina HiSeq 2000. Per fare ciò, saranno necessari 3μg di DNA (concentrazione da 15μL a 200 ng/uL) per campione con successivo sequenziamento di tipo "paired-end" su 2 x 75bp. Le sequenze generate saranno allineate con il genoma di riferimento (build hg19) utilizzando il software BWA. I duplicati (duplicati PCR' e 'duplicati ottici') saranno eliminati come sequenze non appaiate e disallineate (Q-score <20). Le sequenze generate verranno poi ricalibrate dal software GATK per migliorare il rilevamento di tali variazioni di inserimento/cancellazione. Il rilevamento delle varianti verrà effettuato utilizzando il software degli strumenti e l'annotazione utilizzerà il software annovar. Le analisi si concentreranno sulle varianti rilevate con una profondità di almeno 10x. Gli investigatori selezioneranno qualsiasi variante trovata nello stato omozigote nel paziente e nello stato eterozigote con i suoi genitori (ipotesi recessiva). Le varianti trovate omozigoti anche tra i parenti non affetti saranno escluse dalla lista dei candidati. Qualsiasi variante trovata nei pazienti ma assente in entrambi i genitori può anche essere un potenziale candidato in caso de novo I ricercatori ritengono che questa strategia potrebbe facilitare la diagnosi ma anche, dopo la convalida del ruolo di questa variante nella patologia, valutare il rischio di recidiva per famiglie offrendo la diagnosi prenatale se necessario. Fornirà inoltre un supporto il prima possibile a questi bambini, come l'assistenza medica, psicologica e sociale dei bambini con sindrome di Prader-Willi. Infatti, l'esistenza di una diagnosi genetica responsabile del fenotipo consente lo sviluppo di un progetto di vita specifico adattato al paziente e facilita l'aiuto allo sviluppo per la disabilità attraverso i centri di riferimento e la collaborazione con le case dipartimentali per disabili (MDPH). Infine, i progressi nella comprensione dei meccanismi di queste obesità possono aiutare a comprendere meglio la fisiopatologia delle forme più comuni di obesità e migliorarne la gestione.

Selezione del paziente:

Per i bambini e gli adulti con obesità sindromica, il ricovero in regime di day hospital è sistematicamente pianificato nelle cure abituali per eseguire una valutazione clinica e biologica completa. Le informazioni sui vari esami effettuati durante il giorno del ricovero vengono fornite durante un consulto. Lo studio genetico sarà proposto Durante questa consultazione è stato proposto ai pazienti, bambini e adulti, e alle loro famiglie. La data del ricovero è solitamente nel mese successivo alla consultazione.

Inclusione - ricovero ambulatoriale del paziente:

Nell'ambito delle cure abituali, una precisa caratterizzazione fenotipica viene eseguita dallo sperimentatore in day hospital: storia del peso familiare, analisi retrospettiva della storia del peso personale, esame clinico, antropometria, consulenza dietetica, misure della composizione corporea e del dispendio energetico di riposo, cibo e questionari di attività fisica, bilanciati endocrini e metabolici.

La ricerca consisterà in un prelievo di sangue di 20 ml in più per lo studio genetico e sarà condotta in soggetti obesi previa firma di un consenso. I pazienti per i quali i campioni analizzabili sono già conservati nella banca del DNA n. DC2009-957 non verranno prelevati nuovamente.