Phänotypische und genotypische Charakterisierung von Probanden mit syndromischer Adipositas: Identifizierung neuer Kandidatengene durch Exomsequenzierung (OBEXOME) (OBEXOME)

Sequenzierung von Exons:

Bis heute sind die meisten syndromalen Fettleibigkeiten nicht aufgeklärt. Aber der Mangel an Identifizierung der beteiligten molekularen Anomalien beschränkt die Information der Familien über das Rezidivrisiko und die optimale Unterstützung des Patienten.

Ein neues molekularbiologisches Werkzeug namens Sequenzierung von Exons ("Exome") oder gezielte Sequenzierung von Untergruppen des Genoms, die für Proteine ​​​​kodieren, zeigte seine Fähigkeit, Mutationen zu identifizieren, die für seltene Krankheiten verantwortlich sind, bei einer kleinen Anzahl von Personen, die nicht miteinander verwandt waren. Tatsächlich half dieses Tool bei der Identifizierung von zwei Mutationen im Gen TSPAN12 (Tetraspanin 12) bei 23 Patienten mit exsudativer Vitreoretinopathie, 3 Mutationen im Gen PRRT2 (prolinreiches Transmembranprotein 2) in 8 chinesischen Familien mit kinesigener paroxysmaler Dyskinesie, 2 Nonsense-Mutationen im Gen ANGPTL3 (Angiopoietin-like 3) bei 2 Patienten mit familiärer kombinierter Hypolipidämie, eine Mutation des Gens RBM10 (RNA-Bindungsmotiv 10) bei 3 Patienten mit syndromaler Form der Gaumenspalte (TARP-Syndrom) oder eine Mutation des Gen PALB2 (Partner und Lokalisierer von BRCA2) bei einem Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs. Die Forscher glauben, dass dieses Tool neue molekulare Anomalien bei Personen mit syndromaler Fettleibigkeit identifizieren könnte. Die detaillierte Analyse der phänotypischen Daten könnte eine Gruppe adipöser Patienten (mindestens 10) identifizieren, die einen gemeinsamen klinischen und biologischen Phänotyp aufweisen und bei denen diese Technik verwendet werden würde.

Die Exomsequenzierung wird bei Probanden durchgeführt, die anhand ihres Phänotyps ausgewählt wurden, aber auch bei ihren Verwandten (2 Elternteile und ein Geschwister), um zusätzliche Unterscheidungsfähigkeit bereitzustellen. Jede neue Variante, die im homozygoten Zustand bei adipösen Patienten und nicht betroffenen Verwandten gefunden wird, wird sofort von der Liste der Kandidatenmutationen ausgeschlossen. Umgekehrt ist jede Variante, die bei Patienten gefunden wird, aber bei beiden Elternteilen und Geschwistern fehlt, eine potenzielle De-novo-Mutation. In den verschiedenen öffentlichen Exom-Datenbanken (dbSNP, 1000 Genomes, Exome Variant Server) wird nach dem Vorhandensein eines Variantenkandidaten gesucht, und im Falle einer nicht gelisteten Variante wird es möglich sein, in Kohorten von Kindern mit allgemeiner Adipositas und nicht zu genotypisieren -fettleibig, um ihre Häufigkeit zu bestimmen und somit zusätzliche Informationen über ihre potenzielle Beteiligung am Phänotyp der syndromalen Fettleibigkeit zu liefern. Der letzte Schritt, der die Rolle des abweichenden Gens im Krankheitsbild validiert, wird eine In-vitro-Analyse der funktionellen Auswirkungen auf das Protein und dann eine In-vivo-Analyse in Tiermodellen sein.

Die Sequenzierung aller Exons ("Exome") der 40 ausgewählten Probanden (10 Probanden mit Eltern und nicht fettleibigen Geschwistern) wird auf einer genomischen Plattform unter Verwendung eines neuartigen Generationssequenzierers Illumina HiSeq 2000 durchgeführt. Dazu werden pro Probe 3μg DNA (15μL Konzentration auf 200 ng/uL) benötigt mit anschließender Sequenzierung vom Typ „Paired-End“ auf 2 x 75bp. Die generierten Sequenzen werden mit der BWA-Software mit dem Referenzgenom (build hg19) abgeglichen. Duplikate (PCR-Duplikate und „optische Duplikate“) werden als nicht gepaarte und falsch ausgerichtete Sequenzen (Q-Score < 20) eliminiert. Die generierten Sequenzen werden dann von der GATK-Software neu kalibriert, um die Erkennung solcher Variationen durch Insertion/Deletion zu verbessern. Die Erkennung von Varianten wird mithilfe von Tools-Software durchgeführt, und die Annotation erfolgt mithilfe der annovar-Software. Die Analysen konzentrieren sich auf erkannte Varianten mit einer Tiefe von mindestens 10x. Die Ermittler werden jede Variante auswählen, die im homozygoten Zustand beim Patienten und im heterozygoten Zustand bei seinen Eltern gefunden wird (rezessive Hypothese). Varianten, die auch unter den nicht betroffenen Verwandten homozygot gefunden werden, werden von der Kandidatenliste ausgeschlossen. Jede Variante, die bei Patienten gefunden wird, aber bei beiden Elternteilen fehlt, kann auch ein potenzieller Kandidat im Fall de novo sein. Die Forscher glauben, dass diese Strategie die Diagnose erleichtern könnte, aber auch, nach Validierung der Rolle dieser Variante in der Pathologie, das Risiko eines erneuten Auftretens für Familien, indem sie bei Bedarf eine pränatale Diagnostik anbieten. Es wird diesen Kindern auch so früh wie möglich eine Unterstützung zukommen lassen, wie die medizinische, psychologische und soziale Betreuung von Kindern mit Prader-Willi-Syndrom. In der Tat ermöglicht das Vorhandensein einer für den Phänotyp verantwortlichen genetischen Diagnose die Entwicklung eines spezifischen Lebensprojekts, das an den Patienten angepasst ist, und erleichtert die Entwicklungshilfe für Behinderte durch die Referenzzentren und die Zusammenarbeit mit den Abteilungsheimen für behinderte Menschen (MDPH). Schließlich können die Fortschritte beim Verständnis der Mechanismen dieser Adipositas dazu beitragen, die Pathophysiologie der häufigsten Formen von Adipositas besser zu verstehen und die Behandlung zu verbessern.

Patientenauswahl:

Für Kinder und Erwachsene mit syndromaler Adipositas wird der stationäre Aufenthalt systematisch in der Regelversorgung geplant, um eine vollständige klinische und biologische Bewertung durchzuführen. Die Informationen über die verschiedenen Untersuchungen, die am Tag des Krankenhausaufenthalts durchgeführt werden, werden während eines Beratungsgesprächs gegeben. Die genetische Studie wird vorgeschlagen Sie wurde während dieser Konsultation Patienten, Kindern und Erwachsenen und ihren Familien vorgeschlagen. Der Krankenhausaufnahmetermin liegt in der Regel im Monat nach der Konsultation.

Inklusion - Tagesklinikaufenthalt:

Im Rahmen der üblichen Versorgung erfolgt eine genaue phänotypische Charakterisierung durch den Untersucher Tagesklinik: familiäre Gewichtsanamnese, retrospektive Analyse der persönlichen Gewichtsanamnese, klinische Untersuchung, Anthropometrie, Ernährungsberatung, Messung der Körperzusammensetzung und Energieaufwand aus Ruhe, Nahrung u Fragebögen zur körperlichen Aktivität, endokrin und metabolisch ausgewogen.

Die Untersuchung besteht aus einer zusätzlichen Blutprobe von 20 ml für die genetische Studie und wird nach Unterzeichnung einer Einwilligung bei übergewichtigen Personen durchgeführt. Patienten, für die bereits auswertbare Proben in der DNA-Bank Nr. DC2009-957 gespeichert sind, werden nicht erneut beprobt.