Syndroomasta liikalihavuudesta kärsivien potilaiden fenotyyppinen ja genotyyppinen karakterisointi: uusien ehdokasgeenien tunnistaminen Exome-sekvensoinnilla (OBEXOME) (OBEXOME)

Eksonien sekvensointi:

Tähän mennessä useimpia syndroomista liikalihavuuksia ei ole selvitetty. Mutta asiaan liittyvien molekyylipoikkeavuuksien tunnistamisen puute rajoittaa perheille tietoa uusiutumisriskistä ja potilaan optimaalisesta tuesta.

Uusi molekyylibiologian työkalu, jota kutsutaan eksonien sekvensoimiseksi ("eksomi") tai genomin kohdistettu sekvensointiosajoukko, joka koodaa proteiineja, osoitti kykynsä tunnistaa harvinaisista sairauksista vastuussa olevat mutaatiot pienellä määrällä yksilöitä, jotka saavutettiin ilman sukua. Itse asiassa tämä työkalu auttoi tunnistamaan kaksi mutaatiota geenissä TSPAN12 (tetraspaniini 12) 23 potilaalla, joilla oli eksudatiivista vitreo-retinopatiaa, 3 mutaatiota PRRT2-geenissä (proliinirikas transmembraaniproteiini 2) kahdeksassa kiinalaisessa perheessä, joilla oli kinesigeeninen kohtauksellinen dyskinesia, 2 nonsense-mutaatioita ANGPTL3-geenissä (angiopoietiinin kaltainen 3) kahdella potilaalla, joilla on familiaalinen yhdistetty hypolipidemia, RBM10-geenin mutaatio (RNA-sitoutumismotiivi 10) 3 potilaalla, joilla on suulakihalkeama syndroominen muoto (TARP-oireyhtymä) tai mutaatio geeni PALB2 (BRCA2:n kumppani ja paikallistaja) potilaalla, jolla on haimasyöpä. Tutkijat uskovat, että tämä työkalu voisi tunnistaa uusia molekyylipoikkeavuuksia yksilöissä, joilla on oireyhtymälihavuus. Fenotyyppitietojen yksityiskohtainen analyysi voisi tunnistaa ryhmän lihavia potilaita (vähintään 10), joilla on yhteinen kliininen ja biologinen fenotyyppi ja jossa tätä tekniikkaa käytettäisiin.

Exome-sekvensointi suoritetaan koehenkilöillä, jotka valitaan heidän fenotyypinsä perusteella, mutta myös heidän sukulaistensa keskuudessa (2 vanhempaa ja sisarus), jotta saadaan lisää erottelukykyä. Jokainen uusi variantti, joka löydetään homotsygoottisessa tilassa lihavilla potilailla ja omaisilla, joilla ei ole tautia, suljetaan välittömästi pois ehdokasmutaatioiden luettelosta. Sitä vastoin mikä tahansa variantti, joka löytyy potilaista, mutta joka puuttuu molemmista vanhemmista ja sisaruksista, on mahdollinen de novo -mutaatio. Minkä tahansa muunnelman läsnäoloa etsitään erilaisista julkisista exome-tietokannoista (dbSNP, 1000 Genomes, Exome Variant Server), ja listaamattoman variantin tapauksessa on mahdollista genotyypittää kohortteissa lapsia, joilla on yleinen liikalihavuus ja ei -lihava, jotta voidaan määrittää sen esiintymistiheys ja siten antaa lisätietoa sen mahdollisesta osallisuudesta oireyhtymän liikalihavuuden fenotyyppiin. Viimeinen vaihe, joka vahvistaa varianttigeenin roolin kliinisessä kuvassa, on proteiiniin kohdistuvien toiminnallisten seurausten in vitro -analyysi ja sitten in vivo eläinmalleissa.

Kaikkien 40 valitun kohteen (10 koetinta, joilla on molemmat vanhemmat ja ei-lihavat sisarukset) eksonien ("eksomien") sekvensointi suoritetaan genomisella alustalla käyttämällä uudentyyppistä sukupolven sekvensseria Illumina HiSeq 2000. Tätä varten tarvitaan DNA:ta 3 μg (15 μl:n pitoisuus 200 ng/ul:aan) näytettä kohti, minkä jälkeen sekvensoidaan tyypin "paired-end" 2 x 75 bp:llä. Luodut sekvenssit kohdistetaan referenssigenomiin (build hg19) käyttämällä BWA-ohjelmistoa. Kaksoiskappaleet (PCR-kaksoiskappaleet ja optiset kaksoiskappaleet) eliminoidaan parittomina ja väärin kohdistetuina sekvensseinä (Q-pisteet <20). Luodut sekvenssit kalibroidaan sitten uudelleen GATK-ohjelmistolla tällaisten variaatioiden lisäämisen/deleetion havaitsemisen parantamiseksi. Varianttien tunnistaminen suoritetaan työkaluohjelmistolla ja huomautus annovar-ohjelmistolla. Analyysit keskittyvät havaittuihin muunnelmiin, joiden syvyys on vähintään 10x. Tutkijat valitsevat minkä tahansa muunnelman, joka löytyy potilaasta homotsygoottisessa tilassa ja hänen vanhempiensa kanssa heterotsygoottisessa tilassa (resessiivinen hypoteesi). Vaihtoehdot, jotka myös havaitaan homotsygoottisiksi sairastumattomien sukulaisten keskuudessa, suljetaan pois ehdokaslistalta. Mikä tahansa variantti, joka löytyy potilailta, mutta joka puuttuu molemmilta vanhemmilta, voi myös olla mahdollinen ehdokas de novo -tapauksessa. Tutkijat uskovat, että tämä strategia voisi helpottaa diagnoosia, mutta myös tämän variantin roolin patologian vahvistamisen jälkeen arvioida uusiutumisen riskiä. perheille tarjoamalla tarvittaessa synnytysdiagnoosia. Se tarjoaa myös tukea mahdollisimman varhaisessa vaiheessa näille lapsille, kuten Prader-Willin oireyhtymää sairastavien lasten lääketieteelliseen, psykologiseen ja sosiaaliseen hoitoon. Fenotyypistä vastaavan geneettisen diagnoosin olemassaolo mahdollistaakin potilaaseen soveltuvan erityisen elämänprojektin kehittämisen ja helpottaa vammaisten kehitysapua referenssikeskusten ja yhteistyön vammaisten osastojen (MDPH) kanssa. Lopuksi, edistyminen näiden liikalihavuuden mekanismien ymmärtämisessä voi auttaa ymmärtämään paremmin yleisimpien liikalihavuusmuotojen patofysiologiaa ja parantamaan hallintaa.

Potilaan valinta:

Lapsille ja aikuisille, joilla on oireyhtymälihavuus, suunnitellaan järjestelmällisesti päiväsairaalahoito normaalihoidossa täydellisen kliinisen ja biologisen arvioinnin suorittamiseksi. Tietoa sairaalapäivän aikana tehdyistä erilaisista tutkimuksista annetaan konsultaatiossa. Geneettistä tutkimusta ehdotetaan Tämän kuulemisen aikana ehdotettiin potilaille, lapsille ja aikuisille sekä heidän perheilleen. Sairaalahoitopäivä on yleensä konsultaatiota seuraavan kuukauden aikana.

Inkluusio - potilaan päiväsairaalahoito:

Osana tavanomaista hoitoa tutkijan päiväsairaalahoidossa tehdään tarkka fenotyyppinen karakterisointi: perheen painohistoria, henkilökohtaisen painohistorian retrospektiivinen analyysi, kliininen tutkimus, antropometria, ravitsemusneuvonta, kehon koostumuksen ja lepo-, ruoan- ja energiankulutusmittaukset. fyysisen aktiivisuuden kyselylomakkeet, hormonitoiminta ja aineenvaihdunta tasapainossa.

Tutkimus koostuu 20 ml:n ylimääräisestä verinäytteestä geneettistä tutkimusta varten ja se tehdään lihavilla henkilöillä suostumuksen allekirjoittamisen jälkeen. Potilailta, joilta analysoitavia näytteitä on jo tallennettu DNA-pankkiin nro DC2009-957, ei oteta uudelleen näytteitä.