Preexistující mutace kinázové domény u Ph-pozitivních leukémií

Pozadí Jednoduché nebo vícebodové mutace v tyrosinkinázové doméně (TKD) fúzního genu BCR-ABL1 u chronické myeloidní leukémie (CML) a akutní lymfoblastické leukémie s pozitivním Ph-chromozomem představují nejdůležitější známý mechanismus rezistence na inhibitory tyrosinkinázy (TKI). ). Je možné, že již existující bodové mutace v kmenových buňkách CML, které lze připsat genomové nestabilitě udělené fúzním proteinem BCR-ABL1, vedou pod selekčním tlakem terapie TKI k růstu rezistentních subklonů a nástupu onemocnění necitlivého na léčbu. Včasná detekce takových subklonů proto může mít prognostický a terapeutický význam. Nedávno publikovaný imunofenotyp CML kmenových buněk (Hermann et al. Blood 2014) a naše nedávná zpráva o metodě založené na NGS (next-generation sequencing), která usnadňuje citlivou detekci a kvantitativní monitorování subklonů BCR-ABL1 nesoucích jednoduché nebo složené mutace (Kastner et al. European Journal of Cancer 2014) usnadňují screening na klinicky relevantní mutantní subklony v kmenových buňkách nebo časných progenitorových buňkách.

Hypotéza Detekce mutantních subklonů v kmenových buňkách nebo časných progenitorových kompartmentech při diagnóze nebo v rané fázi terapie Ph-pozitivních leukémií a sledování kinetiky jejich proliferace umožňuje včasnou predikci rezistentního onemocnění při probíhající léčbě TKI.

Experimentální přístup Vzorky kostní dřeně (BM) a periferní krve (PB) budou odebírány po informovaném souhlasu pacientů s Ph-pozitivní leukémií při diagnóze (BM+PB) a následně v 3měsíčních intervalech (PB;BM dle dostupnosti) během první rok terapie založené na TKI nebo zahrnující TKI. Izolace CD (shluk diferenciace) 34+ buněk nesoucích další fenotypové markery charakterizující kmenové buňky nebo časné progenitorové buňky (CD38-/CD25+/CD26+ v CML, CD19 v Ph-ALL) bude provedena průtokovým tříděním. Celá BCR-ABL1 tyrozinkinázová doména (TKD) bude amplifikována z cDNA (komplementární DNA) nebo specifických exonů zájmu z DNA zavedenými protokoly a obousměrné sekvenování bude provedeno ultrahlubokým sekvenováním pomocí NGS. Mutantní subklony identifikované při diagnóze nebo po odstranění větší části leukemické zátěže citlivé na léčbu v rané fázi léčby (časový bod 3 měsíce) budou monitorovány NGS do 12. měsíce terapie. Transkripty BCR-ABL1 budou paralelně sledovány podle mezinárodní škály (IS). DNA izolovaná z odřezků nehtů bude použita jako zárodečná kontrola pro ABL1 TKD. Testování bude prováděno zaslepeným způsobem, aby se zabránilo úpravám léčby podle experimentálních dat.