Mutações pré-existentes no domínio quinase em leucemias Ph-positivas

Histórico As mutações pontuais únicas ou múltiplas no domínio da tirosina quinase (TKD) do gene de fusão BCR-ABL1 na leucemia mielóide crônica (LMC) e na leucemia linfoblástica aguda com cromossomo Ph positivo representam o mecanismo conhecido mais importante de resistência aos inibidores da tirosina quinase (TKIs). ). É concebível que mutações pontuais pré-existentes em células-tronco CML atribuíveis à instabilidade genômica conferida pela proteína de fusão BCR-ABL1 dêem origem ao crescimento de subclones resistentes e início de doença insensível ao tratamento sob a pressão de seleção da terapia TKI. A detecção precoce de tais subclones pode, portanto, ser de relevância prognóstica e terapêutica. O imunofenótipo recentemente publicado de células-tronco da LMC (Hermann et al. Blood 2014), e nosso relatório recente sobre um método baseado em NGS (sequenciamento de próxima geração) que facilita a detecção sensível e o monitoramento quantitativo de subclones BCR-ABL1 portadores de mutações simples ou compostas (Kastner et al. European Journal of Cancer 2014) facilitam a triagem de subclones mutantes clinicamente relevantes em células-tronco ou células progenitoras precoces.

Hipótese A detecção de subclones mutantes nas células-tronco ou compartimentos progenitores iniciais no diagnóstico ou no início da terapia de leucemias Ph-positivas e o monitoramento de sua cinética de proliferação permitem a previsão precoce de doença resistente sob o tratamento TKI em andamento.

Abordagem experimental Amostras de medula óssea (BM) e sangue periférico (PB) serão coletadas mediante consentimento informado de pacientes com leucemia Ph-positiva no momento do diagnóstico (BM+PB) e, posteriormente, em intervalos de 3 meses (PB;BM mediante disponibilidade) durante o primeiro ano de terapia baseada ou incluindo TKIs. O isolamento de células CD (cluster de diferenciação) 34+ portadoras de marcadores fenotípicos adicionais caracterizando células-tronco ou células progenitoras precoces (CD38-/CD25+/CD26+ em CML, CD19 em Ph-ALL) será realizado por flow sorting. Todo o domínio tirosina quinase (TKD) BCR-ABL1 será amplificado a partir de cDNA (DNA complementar) ou éxons específicos de interesse do DNA por protocolos estabelecidos, e o sequenciamento bidirecional será realizado por sequenciamento ultraprofundo usando NGS. Subclones mutantes identificados no diagnóstico ou após a redução da maior parte da carga leucêmica sensível ao tratamento no início do tratamento (ponto de tempo de 3 meses), serão monitorados por NGS até o 12º mês de terapia. Os transcritos de BCR-ABL1 serão monitorados de acordo com a Escala Internacional (IS) em paralelo. DNA isolado de recortes de unha será usado como controle germinativo para o ABL1 TKD. O teste será realizado de forma cega para evitar ajustes de tratamento de acordo com dados experimentais.