Mutazioni preesistenti del dominio della chinasi nelle leucemie Ph-positive

Mutazioni puntiformi singole o multiple nel dominio tirosin-chinasico (TKD) del gene di fusione BCR-ABL1 nella leucemia mieloide cronica (LMC) e nella leucemia linfoblastica acuta con cromosoma Ph positivo rappresentano il più importante meccanismo noto di resistenza agli inibitori della tirosin-chinasi (TKI) ). È ipotizzabile che mutazioni puntiformi preesistenti nelle cellule staminali CML attribuibili all'instabilità genomica conferita dalla proteina di fusione BCR-ABL1 diano luogo alla crescita di subcloni resistenti e all'insorgenza di malattie insensibili al trattamento sotto la pressione selettiva della terapia TKI. La diagnosi precoce di tali sottocloni può quindi essere di rilevanza prognostica e terapeutica. L'immunofenotipo delle cellule staminali CML recentemente pubblicato (Hermann et al. Blood 2014) e il nostro recente rapporto su un metodo basato su NGS (sequenziamento di nuova generazione) che facilita il rilevamento sensibile e il monitoraggio quantitativo dei sottocloni BCR-ABL1 portatori di mutazioni singole o composte (Kastner et al. European Journal of Cancer 2014) facilitano lo screening di subcloni mutanti clinicamente rilevanti nelle cellule staminali o nelle cellule progenitrici precoci.

Ipotesi Il rilevamento di subcloni mutanti all'interno della cellula staminale o dei primi compartimenti progenitori alla diagnosi o all'inizio della terapia delle leucemie Ph-positive e il monitoraggio della loro cinetica di proliferazione, consentono la previsione precoce della malattia resistente sotto il trattamento TKI in corso.

Approccio sperimentale Campioni di midollo osseo (BM) e sangue periferico (PB) saranno raccolti su consenso informato da pazienti con leucemia Ph-positiva alla diagnosi (BM+PB), e successivamente ad intervalli di 3 mesi (PB;BM in base alla disponibilità) durante il primo anno di terapia basata o che include TKI. L'isolamento di cellule CD (cluster of differenziation) 34+ portanti ulteriori marcatori fenotipici che caratterizzano le cellule staminali o le cellule progenitrici precoci (CD38-/CD25+/CD26+ nella LMC, CD19 nella LAL-PH) sarà effettuato mediante flow sorting. L'intero dominio tirosina chinasico BCR-ABL1 (TKD) sarà amplificato dal cDNA (DNA complementare) o specifici esoni di interesse dal DNA mediante protocolli stabiliti e il sequenziamento bidirezionale sarà eseguito mediante sequenziamento ultra profondo utilizzando NGS. I sottocloni mutanti identificati alla diagnosi o dopo il debulking della maggior parte del carico leucemico sensibile al trattamento all'inizio del trattamento (punto temporale di 3 mesi), saranno monitorati da NGS fino al mese 12 di terapia. I trascritti di BCR-ABL1 saranno monitorati in parallelo secondo la scala internazionale (IS). Il DNA isolato da ritagli di unghia verrà utilizzato come controllo germinale per ABL1 TKD. I test saranno eseguiti in cieco per evitare aggiustamenti del trattamento in base ai dati sperimentali.