Mutaciones preexistentes del dominio quinasa en leucemias Ph positivas

Antecedentes Las mutaciones puntuales únicas o múltiples en el dominio tirosina quinasa (TKD) del gen de fusión BCR-ABL1 en la leucemia mieloide crónica (LMC) y la leucemia linfoblástica aguda con cromosoma Ph positivo representan el mecanismo conocido más importante de resistencia a los inhibidores de la tirosina quinasa (TKI). ). Es concebible que las mutaciones puntuales preexistentes en las células madre de la CML atribuibles a la inestabilidad genómica conferida por la proteína de fusión BCR-ABL1 den lugar al crecimiento de subclones resistentes y al inicio de una enfermedad insensible al tratamiento bajo la presión de selección de la terapia con TKI. Por lo tanto, la detección temprana de tales subclones puede tener relevancia pronóstica y terapéutica. El inmunofenotipo de células madre de LMC publicado recientemente (Hermann et al. Blood 2014), y nuestro informe reciente sobre un método basado en NGS (secuenciación de próxima generación) que facilita la detección sensible y el control cuantitativo de subclones BCR-ABL1 que portan mutaciones simples o compuestas (Kastner et al. European Journal of Cancer 2014) facilitan la detección de subclones mutantes clínicamente relevantes en células madre o células progenitoras tempranas.

Hipótesis La detección de subclones mutantes dentro de la célula madre o compartimentos progenitores tempranos en el momento del diagnóstico o al comienzo de la terapia de leucemias Ph positivas, y el control de su cinética de proliferación, permiten la predicción temprana de la enfermedad resistente bajo el tratamiento TKI en curso.

Enfoque experimental Se recolectarán muestras de médula ósea (BM) y sangre periférica (PB) con el consentimiento informado de pacientes con leucemia Ph positiva al momento del diagnóstico (BM+PB), y posteriormente a intervalos de 3 meses (PB;BM según disponibilidad) durante el primer año de terapia basada en o incluyendo TKI. El aislamiento de células CD (grupo de diferenciación) 34+ que llevan marcadores fenotípicos adicionales que caracterizan las células madre o las células progenitoras tempranas (CD38-/CD25+/CD26+ en CML, CD19 en Ph-ALL) se realizará mediante clasificación por flujo. Todo el dominio de tirosina quinasa (TKD) BCR-ABL1 se amplificará a partir de ADNc (ADN complementario) o exones específicos de interés del ADN mediante protocolos establecidos, y la secuenciación bidireccional se realizará mediante secuenciación ultraprofunda mediante NGS. Los subclones mutantes identificados en el momento del diagnóstico o después de la reducción de la mayor parte de la carga leucémica sensible al tratamiento al comienzo del tratamiento (punto de tiempo de 3 meses), serán monitoreados por NGS hasta el mes 12 de la terapia. Las transcripciones de BCR-ABL1 se controlarán de acuerdo con la Escala Internacional (IS) en paralelo. El ADN aislado de recortes de uñas se utilizará como control de línea germinal para ABL1 TKD. Las pruebas se realizarán de forma ciega para evitar ajustes en el tratamiento de acuerdo con los datos experimentales.