Strukturální síť pro rakovinu prostaty ve francouzském regionu Greater West (RESCAP)

Relevance a strategický přístup Rakovina prostaty (PCa) je nejčastější rakovina u mužů a druhá hlavní příčina úmrtí na rakovinu v západních zemích. Známými rizikovými faktory jsou pokročilý věk, etnický původ a pozitivní rodinná anamnéza onemocnění (1). Existují značné etnické rozdíly v riziku PCa, s o 60 % vyšší incidencí mezi afroamerickými (AA) muži ve srovnání s evropsko-americkými (EA) muži (2). Podobně ve Francouzské Západní Indii, kde je nejméně 90 % obyvatel afrického původu, je výskyt PCa dvakrát vyšší než ve zbytku Francie (3). Mnoho životních stylů, rizikových faktorů souvisejících s životním prostředím a zaměstnáním, včetně obezity, stravy, léků a pesticidů, se podílí na etiologii PCa, ale jejich role zůstává nejasná (4). Současný výzkum naznačuje, že existuje komplexní souhra genetických a environmentálních faktorů, které mají kauzální roli v PCa.

PCa má také vysoce heterogenní potenciál evoluce. Zatímco některé druhy rakoviny se budou chovat agresivním způsobem, jiní pacienti budou mít indolentní formu onemocnění, která nemůže vyžadovat žádnou léčbu. K predikci rizika evoluce u pacientů s PCa se používá několik parametrů, a to buď před jakoukoli léčbou: klinické stadium, Gleasonovo skóre na biopsiích a sérový prostatický specifický antigen (PSA), nebo po analýze vzorků radikální prostatektomie: patologické stadium a chirurgický Gleason skóre (5). Navzdory hodnotě těchto prognostických faktorů je však při diagnóze stále obtížné vyhodnotit potenciál agresivity a pacienty zařazené do skupiny se středním rizikem je často obtížné zvládnout. Objevit nové markery a nové cíle pro časnou terapeutickou manipulaci je obtížné.

Genetické i environmentální faktory byly spojeny s rizikem agresivních onemocnění. Etnický původ pravděpodobně hraje roli, protože podíl případů diagnostikovaných v metastatickém stadiu se uvádí vyšší u afroamerických pacientů (35 %) než u evropsko-amerických pacientů (22 %), s 2,4násobným vyšší mortalita u mužů s AA než u mužů s EA (2). Zdá se, že spolu s genetickými faktory hrají klíčovou roli v progresi PCa také faktory prostředí. Některé environmentální faktory, jako je obezita, byly spojeny s agresivním PCa (6). Zbývá však ještě hodně pátrat po roli genetických a environmentálních faktorů a jejich vzájemném působení v agresivitě PCa. Bílá tuková tkáň (WAT) a lipidy se potenciálně podílejí na rozvoji a/nebo progresi PCa na mnoha úrovních.

WAT je metabolicky aktivní endokrinní orgán. Adipocyty vylučují různé hormony, bioaktivní peptidy a cytokiny, nazývané adipokiny (9). Několik adipokinů bylo zapojeno do mechanismů vedoucích k progresi a agresivitě PCa, včetně leptinu, interleukinu IL-6 a vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF).

Skladování endokrinních disruptorů. Předpokládá se, že endokrinní disruptory (ED) se podílejí na rakovině prostaty (10). Epidemiologické důkazy o pozitivní souvislosti mezi environmentální expozicí ED jsou však omezené. Dvě studie využívající krevní plazmu nebo břišní tuk k monitorování perzistentních polutantů prokázaly pozitivní souvislosti s rizikem PCa (transchlordan, beta-hexachlorcyklohexan, trans-nonachlor, dieldrin a polychlorovaný bifenyl 153) (11, 12). Nedávná studie provedená ve Francouzské Západní Indii ukázala, že chlordekon, organochlorový pesticid s dobře definovanými estrogenními vlastnostmi, zvyšuje riziko PCa a je spojen s agresivní formou onemocnění u subjektů s pozitivní rodinnou anamnézou PCa (13). .

Složení WAT: Lipidome. Mezi živinami jsou lipidy ve stravě hlavními determinanty celkového složení lipidů WAT, jak bylo hodnoceno během studií dietních intervencí (19–22). Z mastných kyselin jsou esenciální polynenasycené mastné kyseliny (PUFA) podtřídou bioaktivních složek rozdělených do dvou skupin, n-6 a n-3 mastné kyseliny. Řada n-6 zahrnuje prekurzor kyseliny linolové (LA, 18:2n-6). Řada n-3 zahrnuje prekurzor kyseliny alfa-linolenové (ALA, 18:3n-3) a vysoce nenasycené deriváty. Bylo prokázáno, že složení mastných kyselin WAT odráží minulý příjem mastných kyselin (23). Ačkoli neexistují žádné přesvědčivé studie, které by prokazovaly souvislost mezi celkovým příjmem tuků v potravě a rizikem PCa, zdá se, že specifické typy dietních tuků (živočišný tuk) jsou významnější při zvyšování rizika PCa (6, 28). Souvislost mezi konzumací ryb (bohatých na omega-3 PUFA s dlouhým řetězcem) a nižším rizikem rakoviny prostaty je kontroverzní, ale bylo popsáno významné snížení úmrtnosti specifické na rakovinu prostaty (29). Předchozí studie analyzující složení PUFA v tkáních prostaty vedly k protichůdným výsledkům. Složení mastných kyselin WAT však nebylo nikdy studováno u PCa v souvislosti s agresivitou a progresí.

Cílem programu je vytvořit síť sdružující klinické lékaře, patology a vědce věnující se léčbě a výzkumu rakoviny prostaty. Síť vytvoří multicentrickou centralizovanou databázi pacientů s PCa léčených radikální prostatektomií se standardizovaným sběrem biologických zdrojů, včetně vzorků prostaty a tukové tkáně. Využití biozdrojů bude orientováno především na vztahy mezi tukovou tkání/lipidy a agresivitou PCa.

Projekt si klade za cíl charakterizovat souvislost mezi agresivitou PCa a složením tukové tkáně pánve. Vzorky tukové tkáně od pacientů s nízkým rizikem (n=100) nebo agresivním (n=100) PCa budou analyzovány na 1/ lipidový profil (složení mastných kyselin a poměry fosfolipidů), 2/ expresi adipokinů a 3/ perzistentní organické polutanty s aktivitou podobnou hormonům. Analýza zohlední známé faktory agresivity, včetně obezity, složky MetS, etnogeografický původ a pozitivní rodinnou anamnézu onemocnění.

Implementovaná metodika a techniky I- Sestavení databáze a sběr biozdrojů Do kohorty bude zařazen každý pacient s karcinomem prostaty léčený radikální prostatektomií v 7 klinických centrech sítě. Vzhledem k chirurgické činnosti těchto center během posledních 3 let se očekává minimálně 1000 inkluzí po 18 měsících, s přibližně 250 afro-karibskými pacienty. Standardizovaná klinická, biologická a patologická data budou vložena do společného centralizovaného eCRF dostupného v každé centrum (Clinsight®) s centrální správou a validací (tým 13). Finanční podpora bude poskytnuta klinickým týmům pro zadávání dat (technici specializovaní na klinický výzkum).

Do databáze budou vloženy údaje běžně spojené s PCa: administrativní položky (jméno, datum narození, adresa, číslo nemocnice, číslo patologie), předoperační PSA, klinické stadium, patologické položky (váha a velikost vzorku, patologické stadium včetně stav lymfatických uzlin, Gleasonovo skóre, % stupně 4 nebo 5, větší osa hlavního ohniska, stav okraje) a následné položky (biologické i klinické). Dále budou specifikovány tyto položky: BMI, obvod pasu, glykémie nalačno, krevní tlak, cirkulující lipidy (triglyceridy, celkový, LDL a HDL cholesterol), probíhající léčby (léky snižující lipidy, HTA, léčba diabetu), etnogeografický původ a rodinná anamnéza PCa Během chirurgických zákroků 3 kusy bude odebrán vzorek pánevní tukové tkáně (asi 5 g, 2 g a 2 g, pro úkoly 1, 2 a 3 osy 1, v daném pořadí), odeslán do centra biologických zdrojů a okamžitě zmražen na -80 °C. Výzkumníci se rozhodli odebírat vzorky viscerálního WAT místo subkutánního WAT, protože viscerální adipocyty jsou metabolicky aktivnější (8). Mezi viscerální WAT se výzkumníci rozhodli odebírat vzorky perivezikální tukové tkáně, protože tuk kolem močového měchýře je vždy velmi bohatý a lze jej snadno odebrat během chirurgického zákroku. Vzorky prostaty budou okamžitě odeslány na patologická oddělení a budou zpracovány standardizovaným způsobem.

Pacienti zařazení do kohorty budou požádáni, aby podepsali informovaný souhlas (po souhlasu Etické komise/IRB). Komentované biozdroje týkající se předmětů zařazených do programů budou spravovány podle pravidel definovaných CNIL.

Výběr pacientů buď s agresivním nebo nízkorizikovým onemocněním z kohorty z 1000 pacientů očekávaných na M18, bude vybráno 100 pacientů s vysoce agresivním onemocněním. Výběr bude proveden na základě kritérií vysoce rizikového onemocnění, zejména vysokého stupně PCa (Gleasonovo skóre 8 nebo více) a/nebo patologického stadia pT3. Každému z těchto 100 pacientů bude poté přiřazen (střed po středisku) 1 pacient s indolentním onemocněním a identickým stavem pro věk (50 nebo méně, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70, 71-75, více než 75 let) a BMI (normální, s nadváhou a obezitou). Kritéria pro indolentní onemocnění budou zahrnovat předoperační PSA < 10 ng/ml a Gleasonovo skóre 6 nebo méně (na chirurgickém vzorku) a stadium pT2. Pokud by několik indolentních případů mohlo být spojeno s 1 agresivním případem, bude preferován ten s menší velikostí nádoru. Použije se tuková tkáň odebraná od těchto 200 pacientů.

Cílem je identifikovat souvislosti mezi agresivní a významnou PCa a složením tukové tkáně. Výzkumníci předpokládají, že perzistentní organické polutanty (které odrážejí kumulativní minulou expozici) a/nebo složení lipidů (které odrážejí minulý příjem) by mohly být spolu s expresí adipokinů spojeny s agresivitou onemocnění. Budou zohledněny známé faktory agresivity PCa (etnický původ, rodinná anamnéza a stav obezity).

Úkol 1: Analýza lipidů Analýzy provedené na vzorcích tukové tkáně budou: i) složení triglyceridových mastných kyselin a ii) relativní množství tříd fosfolipidů membrán tukových buněk. Pět hlavních tříd fosfolipidů nalezených v plazmatické membráně tukových buněk lze oddělit a kvantifikovat: fosfatidylcholin, fosfatidylethanolamin, fosfatidylinositol, fosfatidylserin a sfingomyelin. Tuková tkáň, která se většinou skládá z triacylglycerolu a pouze přibližně 1 % fosfolipidů, bude studie membránových fosfolipidů vyžadovat větší množství vzorku (5 g), než by bylo typicky nutné pro analýzu složení triglyceridů a mastných kyselin (400-500 mg).

Vzorky tukové tkáně budou podrobeny extrakci lipidů za použití chloroformu a metanolu (podle Folchovy metody). Stručně řečeno, celý extrakt bude vakuově vysušen, poté resolubilizován ve směsi hexanu a methanolu k rozdělení neutrálních (rozpustných v hexanu) a polárních (rozpustných v methanolu) lipidů. Triglyceridy v hexanové fázi budou dále čištěny od jiných neutrálních nebo polárních lipidů pomocí chromatografie na tenké vrstvě na silikagelových deskách. Vyčištěné triglyceridy podstoupí transesterifikaci methanolem za vzniku těkavých mastných kyselin jako methylesterů. Separace a kvantifikace mastných kyselin bude provedena plynovou chromatografií (BPX-70 fázová kapilární kolona, ​​nástřik on-column, plameno-ionizační detektor).

Úkol 2: Měření adipokinu Celková RNA ze vzorků tukové tkáně bude extrahována technikou Trizol a kvalita RNA bude kontrolována gelovou agarózovou elektroforézou a kvantifikací pomocí NanoDrop. Po reverzní transkripci kódující mRNA do cDNA bude provedena kontrola kvality reverzní transkripce PCR amplifikace pomocí housekeeping genu v nízkém počtu cyklů a nové kontroly gelovou agarózou. Kvantitativní PCR v reálném čase pak bude provedena trojmo na devíti zájmových genech (adipokiny) a třech provozních genech pro normalizaci (18S, beta-aktin a SDHA), tj. vygenerováno 10 800 bodů. PCR budou provedeny na 384jamkových destičkách a reakční směsi budou distribuovány robotickou distribucí. Seznam adipokinů (n=9): chemerin, interleukin-6 (IL-6), inhibitor aktivátoru plazminogenu-1 (PAI-1), vazba retinolu protein 4 (RBP4), tumor nekrotizující faktor-alfa (TNF alfa), visfatin, leptin, adiponektin, apelin.

Úkol 3: Měření perzistentních organických polutantů (organochlorové pesticidy) Analytická metodika použitá pro měření cílených organochorových pesticidů je odvozena z postupů dříve vyvinutých, validovaných a akreditovaných pro jiné třídy lipofilních perzistentních organických polutantů, jako jsou dioxiny a sloučeniny PCB. Stručně řečeno, předstupeň využívající zrychlenou extrakci rozpouštědlem (ASE) bude následovat po sobě jdoucí stupně čištění na kolonách s aktivovaným oxidem křemičitým a celitem. Měření bude prováděno pomocí plynové chromatografie spojené s vysokým rozlišením a/nebo tandemovou hmotnostní spektrometrií (GC-HRMS, GC-MS/MS). Kvantifikace bude provedena metodou izotopového ředění (tj. použitím 13C značeného analogicky jako vnitřní standardy). Výběr hlavních cílových látek bude předběžný na základě Stockholmské úmluvy, která uvádí asi 12 hlavních pesticidů vzbuzujících obavy.

Multicentrická standardizovaná klinická a biologická databáze identifikuje 2 homogenní skupiny pacientů s PCa s charakteristikami buď agresivního, nebo potenciálně indolentního onemocnění. Výzkumníci očekávají, že analýza pánevní tukové tkáně ukáže, zda některé kategorie 1/ Lipidy (odrážející dietu), 2/ Adipokiny a 3/ Skladovaná xenobiotika jsou přednostně spojeny s vyšším či nižším rizikem agresivity PCa. Taková identifikace by pak mohla vést k preventivním strategiím.