Strukturális hálózat a prosztatarákról a francia nagy-nyugati régióban (RESCAP)

Relevancia és stratégiai megközelítés A prosztatarák (PCa) a férfiak leggyakoribb rákja, és a nyugati országokban a rákos halálozások második leggyakoribb oka. Ismert kockázati tényezők az előrehaladott életkor, az etnikai származás és a betegség pozitív családi anamnézise (1). Jelentős etnikai különbségek vannak a PCa kockázatát illetően, az afro-amerikai (AA) férfiak körében 60%-kal magasabb az előfordulási arány, mint az európai-amerikai (EA) férfiaknál (2). Hasonlóképpen, a francia Nyugat-Indiában, ahol a lakosság legalább 90%-a afrikai származású, a PCa előfordulása kétszer olyan magas, mint Franciaország többi részén (3). Számos életmód, környezeti és foglalkozási kockázati tényező, köztük az elhízás, az étrend, a gyógyszerek és a peszticidek szerepet játszanak a PCa etiológiájában, de szerepük továbbra sem világos (4). A jelenlegi kutatások azt sugallják, hogy a genetikai és környezeti tényezők összetett kölcsönhatása áll fenn, amelyek okozó szerepet játszanak a PCa kialakulásában.

A PCa is rendkívül heterogén evolúciós potenciállal rendelkezik. Míg egyes rákos megbetegedések agresszíven viselkednek, más betegeknél a betegség indolens formája lesz, amely nem igényel semmilyen kezelést. Számos paramétert használnak a PCa-betegek evolúciós kockázatának előrejelzésére, akár bármilyen kezelés előtt: klinikai stádium, biopsziák Gleason-pontszáma és szérum prosztataspecifikus antigén (PSA), vagy radikális prosztataeltávolítás minták elemzése után: kóros stádium és műtéti Gleason pontszám (5). E prognosztikai tényezők értéke ellenére azonban az agresszivitás lehetőségét továbbra is nehéz felmérni a diagnózis során, és a közepes kockázati csoportba sorolt ​​betegeket gyakran nehéz kezelni. Kihívást jelent új markerek és új célpontok felfedezése a korai terápiás manipulációhoz.

Mind a genetikai, mind a környezeti tényezők összefüggésbe hozhatók az agresszív betegségek kockázatával. Valószínűleg az etnikai származás is szerepet játszik, mivel az áttétes stádiumban diagnosztizált esetek aránya a jelentések szerint magasabb az afro-amerikai betegeknél (35%), mint az európai-amerikai betegeknél (22%), ami 2,4-szeres. magasabb mortalitási arány az AA férfiaknál, mint az EA férfiaknál (2). Úgy tűnik, hogy a genetikai tényezők mellett a környezeti tényezők is kulcsszerepet játszanak a PCa progressziójában. Néhány környezeti tényező, például az elhízás összefüggésbe hozható az agresszív PCa-val (6). Azonban még sokat kell kutatni a genetikai és környezeti tényezők szerepéről, valamint ezek kölcsönhatásáról a PCa agresszivitásában. A fehér zsírszövet (WAT) és a lipidek potenciálisan részt vesznek a PCa kialakulásában és/vagy progressziójában számos szinten.

A WAT egy metabolikusan aktív endokrin szerv. Az adipociták különféle hormonokat, bioaktív peptideket és citokineket választanak ki, amelyeket adipokineknek neveznek (9). Számos adipokin vesz részt a PCa progressziójához és agresszivitásához vezető mechanizmusokban, beleértve a leptint, az interleukin IL-6-ot és a vaszkuláris endoteliális növekedési faktort (VEGF).

Az endokrin rendszert károsító anyagok tárolása. Az endokrin károsítókról (ED) úgy gondolják, hogy szerepet játszanak a prosztatarákban (10). Az ED-nek való környezeti expozíció közötti pozitív kapcsolat epidemiológiai bizonyítékai azonban korlátozottak. Két tanulmány, amelyben vérplazmát vagy hasi zsírt használtak a perzisztens szennyező anyagok megfigyelésére, pozitív összefüggést mutatott ki a PCa kockázatával (transzklordán, béta-hexaklór-ciklohexán, transz-nonaklór, dieldrin és poliklórozott bifenil 153) (11, 12). Egy francia Nyugat-Indiában nemrégiben végzett tanulmány kimutatta, hogy a klórdekon, egy jól meghatározott ösztrogén tulajdonságokkal rendelkező szerves klórtartalmú peszticid növeli a PCa kockázatát, és a betegség agresszív formájához kapcsolódik olyan személyeknél, akiknek a családjában pozitív PCa szerepel (13). .

WAT összetétel: Lipidome. A tápanyagok közül az étrendi lipidek a WAT ​​általános lipidösszetételének fő meghatározói, amint azt az étrendi beavatkozási vizsgálatok során értékelték (19-22). A zsírsavak közül az esszenciális többszörösen telítetlen zsírsavak (PUFA-k) a bioaktív komponensek alosztályát alkotják, amelyek két csoportra oszthatók, az n-6 és n-3 zsírsavakra. Az n-6 sorozat tartalmazza a prekurzor linolsavat (LA, 18:2n-6). Az n-3 sorozat magában foglalja az alfa-linolénsav prekurzorát (ALA, 18:3n-3) és az erősen telítetlen származékokat. Kimutatták, hogy a WAT ​​zsírsav-összetétele tükrözi a múltbeli zsírsavbevitelt (23). Bár nincsenek meggyőző tanulmányok, amelyek összefüggést mutatnának a teljes étkezési zsírbevitel és a PCa kockázata között, úgy tűnik, hogy bizonyos típusú étkezési zsírok (állati zsírok) jelentősebbek a PCa kockázatának növelésében (6, 28). A (hosszú szénláncú omega-3 PUFA-ban gazdag) halfogyasztás és a prosztatarák alacsonyabb kockázata közötti összefüggés ellentmondásos, de a prosztatarák-specifikus mortalitás jelentős csökkenését írták le (29). A prosztataszövetekben a PUFA-k összetételét elemző korábbi vizsgálatok ellentmondó eredményekhez vezettek. A WAT zsírsavösszetételét azonban soha nem vizsgálták PCa-ban az agresszivitással és a progresszióval összefüggésben.

A program célja a prosztatarák kezelésével és kutatásával foglalkozó klinikusok, patológusok és tudósok hálózatának felépítése. A hálózat multicentrikus központosított adatbázist hoz létre a radikális prosztatektómiával kezelt PCa-betegekről, szabványosított bioerőforrás-gyűjtéssel, beleértve a prosztata- és zsírszövetmintákat is. A bio-erőforrások felhasználása elsősorban a zsírszövet/lipidek és a PCa agresszivitása közötti összefüggésekre irányul majd.

A projekt célja a PCa agresszivitása és a kismedencei zsírszövet összetétele közötti összefüggés jellemzése. Az alacsony kockázatú (n=100) vagy agresszív (n=100) PCa-s betegek zsírszövetmintáit elemzik 1/ lipidprofil (zsírsav-összetétel és foszfolipidek aránya), 2/ adipokin expresszió és 3/ perzisztens hormonszerű aktivitású szerves szennyezők. Az elemzés figyelembe veszi az agresszivitás ismert tényezőit, beleértve az elhízást, a MetS összetevőket, az etnoföldrajzi eredetet és a betegség pozitív családi anamnézisét.

Megvalósított módszertan és technikák I- Az adatbázis és a bioforrás-gyűjtemény felépítése A hálózat 7 klinikai központjában minden radikális prostatectomiával kezelt prosztatarákos beteg bekerül a kohorszba. Tekintettel ezeknek a központoknak az elmúlt 3 évben végzett sebészeti tevékenységére, 18 hónap után legalább 1000 zárvány várható, mintegy 250 afrikai-karibi beteggel. A szabványos klinikai, biológiai és patológiai adatokat egy közös központosított eCRF-be kell bevinni, amely elérhető minden központ (Clinsight®) központi kezeléssel és érvényesítéssel (13. csapat). A klinikai csoportok (klinikai kutatásra szakosodott technikusok) számára pénzügyi támogatást kapnak az adatok beviteléhez.

A PCa-val általánosan összefüggő adatok kerülnek be az adatbázisba: adminisztratív elemek (név, születési hely, cím, kórházi szám, patológiai szám), preoperatív PSA, klinikai stádium, kóros adatok (a minta tömege és mérete, kóros stádium, beleértve nyirokcsomó-státusz, Gleason-pontszám, 4-5-ös fokozat százaléka, a fő fókusz nagyobb tengelye, margin állapot) és nyomon követési tételek (biológiai és klinikai). éhgyomri glükóz, vérnyomás, keringő lipidek (trigliceridek, össz-, LDL és HDL koleszterin), folyamatban lévő kezelések (lipidcsökkentő szerek, HTA, diabétesz kezelések), etnoföldrajzi származás, és a PCa családtörténete A műtéti beavatkozások során 3 db. kismedencei zsírszövetből (körülbelül 5 g, 2 g és 2 g, az 1. tengely 1., 2. és 3. feladatához) mintát vesznek, elküldik a biológiai erőforrás-központba, és azonnal lefagyasztják -80 °C-on. A kutatók úgy döntenek, hogy a szubkután WAT helyett viscerális WAT-mintát vesznek, mivel a zsigeri zsírsejtek metabolikusan aktívabbak (8). A zsigeri WAT közül a vizsgálók a perivesicalis zsírszövet mintáját választják, mivel a hólyag körüli zsír mindig nagyon bőséges, és a műtét során könnyen bevehető. A prosztata mintákat azonnal a patológiai osztályokra küldik, és standardizált módon kezelik.

A kohorszba tartozó betegeket felkérik, hogy aláírják a beleegyezésüket (az Etikai Bizottság/IRB egyetértésével). A programokban szereplő tantárgyakat érintő, annotált bioforrások kezelése a CNIL által meghatározott szabályok szerint történik.

Agresszív vagy alacsony kockázatú betegségben szenvedő betegek kiválasztása az M18-nál várható 1000 betegből, 100 erősen agresszív betegségben szenvedő beteg kerül kiválasztásra. A kiválasztást a magas kockázatú betegség, elsősorban a magas fokú PCa (Gleason-pontszám 8 vagy több) és/vagy a patológiás stádiumú pT3 kritériumai alapján végzik. Ezt a 100 beteget ezután (központonként) egy-egy indolens betegségben szenvedő, életkora szerint azonos státuszú beteggel (50 vagy annál fiatalabb, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70, 71-75, több mint 75 éves) és a BMI (normál, túlsúlyos és elhízott). Az indolens betegség kritériumai közé tartozik a preoperatív PSA < 10 ng/ml, és a Gleason pontszám 6 vagy kevesebb (a műtéti mintán), valamint a pT2 stádium. Ha több indolens eset is párosítható 1 agresszív esettel, akkor a kisebb daganatos esetet részesítjük előnyben. Ebből a 200 betegből vett zsírszövetet használják fel.

A cél az agresszív és jelentős PCa és a zsírszövet összetétele közötti összefüggések azonosítása. A kutatók azt feltételezik, hogy a perzisztens szerves szennyezők (amelyek kumulatív múltbeli expozíciót tükröznek) és/vagy lipidösszetétel (amelyek a múltbeli bevitelt tükrözik) az adipokin expressziójával együtt összefüggésbe hozhatók a betegség agresszivitásával. Figyelembe kell venni a PCa agresszivitásának ismert tényezőit (etnikai származás, családi előzmény és elhízás állapota).

1. feladat: Lipidom analízis A zsírszövetmintákon végzett elemzések a következők: i) triglicerid zsírsav összetétel és ii) zsírsejtek membrán foszfolipid osztályok relatív mennyiségei. A zsírsejtek plazmamembránjában található öt fő foszfolipidek osztálya elkülöníthető és mennyiségileg meghatározható: foszfatidilkolin, foszfatidil-etanol-amin, foszfatidil-inozitol, foszfatidil-szerin és szfingomielin. Mivel a zsírszövet túlnyomórészt triacilglicerinből és csak körülbelül 1% foszfolipidekből áll, a membránfoszfolipidek vizsgálatához nagyobb mintamennyiségre (5 g) lesz szükség, mint a trigliceridek zsírsavösszetételének elemzéséhez (400-500 mg).

A zsírszövetmintákat kloroformmal és metanollal (Folch-módszer szerint) lipidextrakciónak vetik alá. Röviden, a teljes kivonatot vákuumban szárítjuk, majd hexán és metanol elegyében feloldjuk semleges (hexánban oldható) és poláris (metanolban oldható) lipidekké. A hexános fázisban lévő triglicerideket szilikagél lemezeken vékonyréteg-kromatográfiával tovább tisztítjuk más semleges vagy poláris lipidektől. A tisztított triglicerideket metanollal átészterezve illékony zsírsavakat állítanak elő metil-észterek formájában. A zsírsavak szétválasztása és mennyiségi meghatározása gázkromatográfiával történik (BPX-70 fázisú kapilláris oszlop, oszlopra történő befecskendezés, lángionizációs detektor).

2. feladat: Adipokine mérések A zsírszövetmintákból a teljes RNS-t Trizol technikával extraháljuk, az RNS minőségét pedig gél-agaróz elektroforézissel és a NanoDrop kvantifikációval ellenőrizzük. A kódoló mRNS cDNS-vé történő reverz transzkripciója után a reverz transzkripciós PCR-amplifikáció minőségi kontrollját egy housekeeping gén alkalmazásával, alacsony ciklusszámban és új, gél-agarózzal végzett kontrollt végezzük. Ezt követően a valós idejű kvantitatív PCR-t három példányban kilenc érdeklődésre számot tartó génen (adipokinek) és három, a normalizálás céljából gazdálkodó génen (18S, béta-aktin és SDHA), azaz 10 800 pontot generálják. A PCR-eket 384 lyukú lemezeken készítik el, és a reakcióelegyeket roboteloszlás szerint osztják el. Adipokine lista (n=9): chemerin, interleukin-6 (IL-6), plazminogén aktivátor inhibitor-1 (PAI-1), retinol kötődés protein 4 (RBP4), tumor nekrózis faktor-alfa (TNF alfa), viszfatin, leptin, adiponektin, apelin.

3. feladat: A környezetben tartósan megmaradó szerves szennyező anyagok mérése (klórorganikus peszticidek) A célzott szerves klór peszticidek mérésére használt analitikai módszertan a lipofil perzisztens szerves szennyező anyagok más osztályaira, például dioxinokra és PCB vegyületekre korábban kidolgozott, validált és akkreditált eljárásokból származik. Röviden, a gyorsított oldószeres extrakciót (ASE) használó előzetes lépést egymást követő tisztítási lépések követik aktivált szilícium-dioxid és celite oszlopokon. A mérést nagy felbontású gázkromatográfiával és/vagy tandem tömegspektrometriával (GC-HRMS, GC-MS/MS) kapcsolva végezzük. A mennyiségi meghatározást az izotópos hígítási módszer szerint kell elvégezni (vagyis belső standardként analóg módon jelölt 13C-t használva). A fő célzott anyagok kiválasztása előzetes a Stockholmi Egyezmény alapján, amely mintegy 12 fő aggodalomra okot adó növényvédő szert sorol fel.

A multicentrikus standardizált klinikai és biológiai adatbázis a PCa-betegek 2 homogén csoportját azonosítja, amelyek agresszív vagy potenciálisan indolens betegségre jellemzőek. A kutatók arra számítanak, hogy a kismedencei zsírszövet elemzése megmutatja, hogy az 1/ lipidek (az étrendet tükröző), 2/ az adipokinok és a 3/ a tárolt xenobiotikumok bizonyos kategóriái előnyösen összefüggésbe hozhatók-e a PCa agresszivitásának nagyobb vagy alacsonyabb kockázatával. Az ilyen azonosítás aztán megelőző stratégiákhoz vezethet.