Eturauhassyövän rakenneverkosto Ranskan suurlänsialueella (RESCAP)

Relevanssi ja strateginen lähestymistapa Eturauhassyöpä (PCa) on miesten yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syöpäkuolemien syy länsimaissa. Tunnettuja riskitekijöitä ovat pitkä ikä, etninen alkuperä ja sairauden myönteinen suvuhistoria (1). PCa-riskissä on huomattavia etnisiä eroja, ja ilmaantuvuus on 60 % korkeampi afroamerikkalaisten (AA) miesten keskuudessa verrattuna eurooppalais-amerikkalaisten (EA) miehiin (2). Vastaavasti Ranskan Länsi-Intiassa, jossa vähintään 90 % asukkaista on afrikkalaista syntyperää, PCa:n ilmaantuvuus on kaksi kertaa korkeampi kuin muualla Ranskassa (3). Monet elämäntavat, ympäristöön ja työhön liittyvät riskitekijät, mukaan lukien liikalihavuus, ruokavalio, lääkkeet ja torjunta-aineet, on liitetty PCa:n etiologiaan, mutta niiden roolit ovat edelleen epäselviä (4). Nykyiset tutkimukset viittaavat siihen, että geneettisten ja ympäristötekijöiden monimutkainen vuorovaikutus vaikuttaa PCa:han.

PCa:lla on myös erittäin heterogeeninen evoluutiopotentiaali. Vaikka jotkut syövät käyttäytyvät aggressiivisesti, toisilla potilailla on taudin laiska muoto, joka ei ehkä vaadi hoitoa. PCa-potilaiden evoluutioriskin ennustamiseen käytetään useita parametreja joko ennen hoitoa: kliininen vaihe, Gleason-pisteet biopsioista ja seerumin eturauhasspesifinen antigeeni (PSA), tai radikaalien prostatektomianäytteiden analyysin jälkeen: patologinen vaihe ja kirurginen Gleason pisteet (5). Huolimatta näiden ennustetekijöiden arvosta, aggressiivisuuden potentiaalia on edelleen vaikea arvioida diagnoosin yhteydessä, ja keskitason riskiryhmään luokiteltuja potilaita on usein vaikea hallita. Haasteena on löytää uusia markkereita ja uusia kohteita varhaiselle terapeuttiselle manipulaatiolle.

Sekä geneettiset että ympäristötekijät on yhdistetty aggressiivisen sairauden riskiin. Etnisellä alkuperällä on todennäköisesti merkitystä, koska metastaattisessa vaiheessa diagnosoitujen tapausten osuuden on raportoitu olevan suurempi afroamerikkalaispotilailla (35 %) kuin eurooppalaisamerikkalaisilla potilailla (22 %), ja se on 2,4-kertainen. korkeampi kuolleisuus AA-miehillä kuin EA-miehillä (2). Geneettisten tekijöiden lisäksi myös ympäristötekijöillä näyttää olevan keskeinen rooli PCa:n etenemisessä. Jotkut ympäristötekijät, kuten liikalihavuus, on yhdistetty aggressiiviseen PCa:han (6). Paljon on kuitenkin vielä tutkimatta geneettisten ja ympäristötekijöiden roolista ja niiden vuorovaikutuksesta PCa-agressiivuudessa. Valkoinen rasvakudos (WAT) ja lipidit voivat mahdollisesti osallistua PCa:n kehittymiseen ja/tai etenemiseen monilla tasoilla.

WAT on metabolisesti aktiivinen hormonaalinen elin. Adiposyytit erittävät erilaisia ​​hormoneja, bioaktiivisia peptidejä ja sytokiinejä, joita kutsutaan adipokiineiksi (9). Useat adipokiinit ovat olleet mukana mekanismeissa, jotka johtavat PCa:n etenemiseen ja aggressiivisuuteen, mukaan lukien leptiini, interleukiini IL-6 ja verisuonten endoteelikasvutekijä (VEGF).

Hormonitoimintaa häiritsevien aineiden varastointi. Endokriinisten häiriöiden (ED) uskotaan liittyvän eturauhassyöpään (10). Epidemiologinen näyttö positiivisesta yhteydestä ympäristön ED-altistumisen välillä on kuitenkin rajallista. Kaksi tutkimusta, joissa käytettiin veriplasmaa tai vatsan rasvaa pysyvien epäpuhtauksien seurantaan, ovat osoittaneet positiivisia assosiaatioita PCa-riskin kanssa (transklordaani, beeta-heksakloorisykloheksaani, trans-nonakloori, dieldriini ja polykloorattu bifenyyli 153) (11, 12). Äskettäin Ranskan Länsi-Intiassa tehty tutkimus osoitti, että klooridekoni, organoklooripitoinen torjunta-aine, jolla on hyvin määritellyt estrogeeniset ominaisuudet, lisää PCa-riskiä ja liittyy taudin aggressiiviseen muotoon henkilöillä, joiden suvussa on positiivinen PCa-tapaus (13). .

WAT-koostumus: Lipidome. Ravintoaineista ravinnon lipidit ovat tärkeimpiä WAT:n lipidikoostumuksen määrääviä tekijöitä, kuten ravinnon interventiotutkimuksissa arvioitiin (19-22). Rasvahapoista välttämättömät monityydyttymättömät rasvahapot (PUFA) ovat bioaktiivisten komponenttien alaluokka, joka on jaettu kahteen ryhmään, n-6- ja n-3-rasvahappoihin. n-6-sarjaan kuuluu esiaste linolihappo (LA, 18:2n-6). n-3-sarjaan kuuluu esiaste alfa-linoleenihappo (ALA, 18:3n-3) ja erittäin tyydyttymättömät johdannaiset. WAT:n rasvahappokoostumuksen on osoitettu heijastavan aiempia rasvahappojen saantia (23). Vaikka ei ole olemassa vakuuttavia tutkimuksia, jotka osoittaisivat yhteyttä ravinnon rasvan kokonaissaannin ja PCa-riskin välillä, tietyt ravinnon rasvatyypit (eläinrasvat) näyttävät olevan merkittävämpiä PCa-riskin lisäämisessä (6, 28). Kalan kulutuksen (joka sisältää runsaasti pitkäketjuisia omega-3 PUFA:ita) ja eturauhassyövän riskin välinen yhteys on kiistanalainen, mutta eturauhassyöpäspesifisen kuolleisuuden on kuvattu merkittävästi vähentyneen (29). Aiemmat tutkimukset, joissa analysoitiin PUFA:iden koostumusta eturauhaskudoksissa, ovat johtaneet ristiriitaisiin tuloksiin. WAT:n rasvahappokoostumusta ei kuitenkaan ole koskaan tutkittu PCa:ssa aggressiivisuuden ja etenemisen yhteydessä.

Ohjelman tavoitteena on muodostaa verkosto, joka yhdistää eturauhassyövän hallintaan ja tutkimukseen omistautuneita kliinikkoja, patologieja ja tutkijoita. Verkosto tuottaa monikeskeisen keskitetyn tietokannan radikaalilla eturauhasen poistolla hoidetuista PCa-potilaista ja standardoidusta bioresurssien keräämisestä, mukaan lukien eturauhas- ja rasvakudosnäytteet. Bioresurssien käyttö suuntautuu pääasiassa rasvakudoksen/lipidien ja PCa-aggressiivisuuden välisiin suhteisiin.

Hankkeen tavoitteena on karakterisoida PCa-agressiivisuuden ja lantion rasvakudoksen koostumuksen välistä yhteyttä. Rasvakudosnäytteistä potilailta, joilla on joko pieni riski (n=100) tai aggressiivinen (n=100) PCa, analysoidaan 1/ lipidiprofiili (rasvahappokoostumus ja fosfolipidien suhteet), 2/ adipokiinien ilmentyminen ja 3/ pysyvä orgaaniset epäpuhtaudet, joilla on hormonin kaltaista toimintaa. Analyysissa otetaan huomioon tunnetut aggressiivisuustekijät, mukaan lukien liikalihavuus, MetS-komponentit, etnomaantieteellinen alkuperä ja sairauden positiivinen sukuhistoria.

Toteutetut menetelmät ja tekniikat I- Tietokannan ja bioresurssien kokoelman perustaminen Jokainen verkoston 7 kliinisen keskuksen radikaalilla prostatektomialla hoidettu eturauhassyöpäpotilas otetaan mukaan kohorttiin. Kun otetaan huomioon näiden keskusten kirurginen toiminta viimeisten kolmen vuoden aikana, 18 kuukauden kuluttua odotetaan vähintään 1 000 sulkeutumista noin 250 afrikkalais-karialaisella potilaalla. Standardoidut kliiniset, biologiset ja patologiset tiedot syötetään yhteiseen keskitettyyn eCRF:ään, joka on saatavilla jokainen keskus (Clinsight®), jossa on keskitetty hallinta ja validointi (Tiimi 13). Kliinisille ryhmille (kliiniseen tutkimukseen erikoistuneet teknikot) tarjotaan taloudellista tukea tietojen syöttämiseen.

Tietokantaan syötetään yleisesti PCa:han liittyvät tiedot: hallinnolliset tiedot (nimi, syntymäpaikka, osoite, sairaalan numero, patologian numero), ennen leikkausta PSA, kliininen vaihe, patologiset tiedot (näytteen paino ja koko, patologinen vaihe, mukaan lukien imusolmukkeiden tila, Gleason-pisteet, % arvosanasta 4–5, pääpainopisteen suurempi akseli, marginaalin tila) ja seurantakohteet (sekä biologiset että kliiniset). Myös seuraavat tiedot määritetään: BMI, vyötärön ympärysmitta, paastoglukoosi, verenpaine, verenkierrossa olevat lipidit (triglyseridit, kokonais-, LDL- ja HDL-kolesteroli), meneillään olevat hoidot (lipidejä alentavat lääkkeet, HTA, diabeteksen hoidot), etnomaantieteellinen alkuperä ja PCa:n sukuhistoria Leikkausten aikana 3 kpl. lantion rasvakudosta (noin 5 g, 2 g ja 2 g, vastaavasti akselin 1 tehtäviä 1, 2 ja 3 varten) otetaan näyte, lähetetään biologiseen resurssikeskukseen ja pakastetaan välittömästi -80 °C:seen. Tutkijat valitsevat näytteen viskeraalisesta WAT:sta ihonalaisen WAT:n sijaan, koska viskeraaliset rasvasolut ovat metabolisesti aktiivisempia (8). Viskeraalisen WAT:n joukossa tutkijat valitsevat näytteen perivesikaalisesta rasvakudoksesta, koska rakon ympärillä olevaa rasvaa on aina erittäin runsaasti ja se voidaan ottaa helposti leikkauksen aikana. Eturauhasnäytteet lähetetään välittömästi patologian osastoille, ja niitä käsitellään standardoidulla tavalla.

Kohorttiin kuuluvia potilaita pyydetään allekirjoittamaan tietoinen suostumus (eettisen komitean/IRB:n suostumuksella). Ohjelmiin kuuluvia aiheita koskevia selostettuja bioresursseja hoidetaan CNIL:n määrittelemien sääntöjen mukaisesti.

Potilaat, joilla on joko aggressiivinen tai matalan riskin sairaus, valitaan kohortista 1000 potilaasta, joiden odotetaan olevan M18, 100 potilasta, joilla on erittäin aggressiivinen sairaus. Valinta tehdään korkean riskin sairauden kriteerien perusteella, pääasiassa korkea-asteisen PCa:n (Gleason-pistemäärä 8 tai enemmän) ja/tai patologisen vaiheen pT3 perusteella. Jokainen näistä 100 potilaasta yhdistetään sitten (keskikohtaisesti) 1 potilaaseen, jolla on laiska sairaus ja samanlainen iän (50 tai vähemmän, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70, 71-75, yli 75 vuotta vanha) ja BMI (normaali, ylipainoinen ja lihava). Indolentin taudin kriteereitä ovat ennen leikkausta PSA < 10 ng/ml ja Gleasonin pistemäärä 6 tai vähemmän (kirurgisessa näytteessä) ja pT2-vaihe. Jos useat laittomat tapaukset voitaisiin yhdistää yhteen aggressiiviseen tapaukseen, on parempi se, jonka kasvainkoko on pienempi. Näiltä 200 potilaalta otettua rasvakudosta käytetään.

Tavoitteena on tunnistaa yhteyksiä aggressiivisen ja merkittävän PCa:n ja rasvakudoksen koostumuksen välillä. Tutkijat olettavat, että pysyvät orgaaniset epäpuhtaudet (jotka heijastavat kumulatiivista aikaisempaa altistumista) ja/tai lipidikoostumus (jotka heijastavat aikaisempaa saantia) voivat yhdessä adipokiinien ilmentymisen kanssa liittyä taudin aggressiivisuuteen. PCa-aggressiivisuuden tunnetut tekijät (etninen alkuperä, sukuhistoria ja liikalihavuus) otetaan huomioon.

Tehtävä 1: Lipidiomianalyysi Rasvakudosnäytteille suoritettavat analyysit ovat: i) triglyseridirasvahappokoostumus ja ii) rasvasolujen kalvojen fosfolipidiluokkien suhteelliset määrät. Viisi pääasiallista fosfolipidiluokkaa, jotka löytyvät rasvasolujen plasmakalvosta, voidaan erottaa ja kvantifioida: fosfatidyylikoliini, fosfatidyylietanoliamiini, fosfatidyyli-inositoli, fosfatidyyliseriini ja sfingomyeliini. Koska rasvakudos koostuu enimmäkseen triasyyliglyserolista ja vain noin 1 % fosfolipideistä, kalvofosfolipidien tutkiminen vaatii suurempia näytemääriä (5 g) kuin mitä tyypillisesti tarvitaan triglyseridien rasvahappokoostumusanalyysiin (400-500 mg).

Rasvakudosnäytteille suoritetaan lipidiuutto käyttämällä kloroformia ja metanolia (Folchin menetelmän mukaan). Lyhyesti sanottuna kokonaisuute tyhjökuivataan ja liuotetaan sitten uudelleen heksaanin ja metanolin seokseen jakaantumaan neutraaleiksi (heksaaniliukoinen) ja polaariseksi (metanoliliukoinen) lipideiksi. Heksaanifaasissa olevat triglyseridit puhdistetaan edelleen muista neutraaleista tai polaarisista lipideistä ohutkerroskromatografialla silikageelilevyillä. Puhdistetut triglyseridit läpi esteröidään metanolilla haihtuvien rasvahappojen tuottamiseksi metyyliestereinä. Rasvahappojen erotus ja kvantifiointi suoritetaan kaasukromatografialla (BPX-70-faasikapillaarikolonni, pylväs-injektio, liekki-ionisaatiodetektori).

Tehtävä 2: Adipokiinimittaukset Kokonais-RNA rasvakudosnäytteistä uutetaan Trizol-tekniikalla ja RNA:n laatu tarkistetaan geeliagaroosielektroforeesilla ja kvantifiointi NanoDropilla. Koodaavan mRNA:n käänteistranskription cDNA:ksi jälkeen käänteistranskription PCR-monistuksen kontrollilaatu suoritetaan käyttämällä housekeeping-geeniä pienessä syklien lukumäärässä ja uutta kontrollia geeliagaroosilla. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR suoritetaan sitten kolmena rinnakkaisena yhdeksän kiinnostavan geenin (adipokiinit) ja kolmen taloudenpitogeenin normalisointia varten (18S, beeta-aktiini ja SDHA), eli 10 800 pistettä tuotetaan. PCR:t tehdään 384-kuoppaisille levyille ja reaktioseokset jaetaan robottijakauman mukaan. Adipokiiniluettelo (n=9): kemeriini, interleukiini-6 (IL-6), plasminogeeniaktivaattori-inhibiittori-1 (PAI-1), retinolin sitoutuminen proteiini 4 (RBP4), tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-alfa), visfatiini, leptiini, adiponektiini, apeliin.

Tehtävä 3: Pysyvien orgaanisten epäpuhtauksien mittaukset (orgaaniset klooritorjunta-aineet) Kohdennettujen orgaanisten klooripitoisten torjunta-aineiden mittaamiseen käytetty analyyttinen menetelmä on johdettu menetelmistä, jotka on aiemmin kehitetty, validoitu ja akkreditoitu muille lipofiilisten pysyvien orgaanisten yhdisteiden, kuten dioksiinien ja PCB-yhdisteiden, luokille. Lyhyesti sanottuna alustavaa vaihetta, jossa käytetään nopeutettua liuotinuuttoa (ASE), seuraa peräkkäiset puhdistusvaiheet aktivoiduilla piidioksidi- ja seliittikolonneilla. Mittaus suoritetaan käyttämällä kaasukromatografiaa, joka on kytketty korkearesoluutioon ja/tai tandem-massaspektrometriaan (GC-HRMS, GC-MS/MS). Kvantitointi suoritetaan isotooppilaimennusmenetelmän mukaisesti (eli käyttämällä analogisesti leimattua 13C:tä sisäisinä standardeina). Tärkeimmät kohdeaineet valitaan alustavasti Tukholman yleissopimuksen perusteella, jossa luetellaan noin 12 suurinta huolta aiheuttavaa torjunta-ainetta.

Monikeskusstandardoitu kliininen ja biologinen tietokanta tunnistaa 2 homogeenista PCa-potilaiden ryhmää, joilla on joko aggressiivisen tai mahdollisesti indolentin sairauden ominaisuuksia. Tutkijat odottavat, että lantion rasvakudoksen analyysi osoittaa, liittyvätkö jotkin 1/ lipidit (heijastavat ruokavaliota), 2/ adipokiinit ja 3/ varastoidut ksenobiootit ensisijaisesti suurempaan tai pienempään PCa-aggressiivisuuden riskiin. Tällainen tunnistaminen voisi sitten johtaa ennaltaehkäiseviin strategioihin.