Sieć strukturalna ds. raka prostaty we francuskim regionie Wielkiego Zachodu (RESCAP)

Trafność i podejście strategiczne Rak gruczołu krokowego (PCa) jest najczęstszym nowotworem u mężczyzn i drugą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu raka w krajach zachodnich. Znane czynniki ryzyka to zaawansowany wiek, pochodzenie etniczne i dodatni wywiad rodzinny w kierunku tej choroby (1). Istnieją znaczne różnice etniczne w ryzyku PCa, przy 60% wyższym współczynniku zapadalności wśród Afroamerykanów (AA) w porównaniu z Europejczykami (EA) (2). Podobnie we francuskich Indiach Zachodnich, gdzie co najmniej 90% mieszkańców jest pochodzenia afrykańskiego, częstość występowania PCa jest dwukrotnie wyższa niż w pozostałej części Francji (3). Wiele czynników ryzyka związanych ze stylem życia, środowiskiem i pracą, w tym otyłością, dietą, lekami i pestycydami, bierze udział w etiologii PCa, ale ich rola pozostaje niejasna (4). Obecne badania sugerują, że istnieje złożona zależność między czynnikami genetycznymi i środowiskowymi, które odgrywają rolę sprawczą w PCa.

PCa ma również wysoce niejednorodny potencjał ewolucji. Podczas gdy niektóre nowotwory będą zachowywać się agresywnie, inni pacjenci będą mieli leniwą postać choroby, która nie może wymagać żadnego leczenia. Do przewidywania ryzyka ewolucji u pacjentów z rakiem stercza stosuje się kilka parametrów, zarówno przed jakimkolwiek leczeniem: stadium kliniczne, wynik Gleasona w biopsjach i swoisty antygen sterczowy (PSA) w surowicy, jak i po analizie próbek po radykalnej prostatektomii: stadium patologiczne i chirurgiczny Gleason wynik (5). Jednak pomimo wartości tych czynników prognostycznych, potencjał agresywności pozostaje trudny do oszacowania w momencie rozpoznania, a pacjenci sklasyfikowani w grupie średniego ryzyka są często trudni w leczeniu. Wyzwaniem jest odkrycie nowych markerów i nowych celów dla wczesnych manipulacji terapeutycznych.

Zarówno czynniki genetyczne, jak i środowiskowe zostały powiązane z ryzykiem agresywnej choroby. Pochodzenie etniczne prawdopodobnie odgrywa pewną rolę, ponieważ odsetek przypadków rozpoznanych na etapie przerzutów jest wyższy wśród pacjentów pochodzenia afroamerykańskiego (35%) niż pacjentów pochodzenia europejskiego (22%), z 2,4-krotnym wyższy wskaźnik śmiertelności u mężczyzn AA niż u mężczyzn EA (2). Wraz z czynnikami genetycznymi, czynniki środowiskowe wydają się również odgrywać kluczową rolę w progresji PCa. Niektóre czynniki środowiskowe, takie jak otyłość, zostały powiązane z agresywnym PCa (6). Jednak wiele pozostaje do zbadania na temat roli czynników genetycznych i środowiskowych oraz ich wzajemnego oddziaływania na agresywność PCa. Biała tkanka tłuszczowa (WAT) i lipidy są potencjalnie zaangażowane w rozwój i/lub progresję PCa na wielu poziomach.

WAT jest metabolicznie aktywnym narządem wydzielania wewnętrznego. Adipocyty wydzielają różne hormony, bioaktywne peptydy i cytokiny, zwane adipokinami (9). Kilka adipokin było zaangażowanych w mechanizmy prowadzące do progresji i agresywności PCa, w tym leptyna, interleukina IL-6 i czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF).

Przechowywanie substancji zaburzających gospodarkę hormonalną. Uważa się, że substancje zaburzające gospodarkę hormonalną (ED) są zaangażowane w raka prostaty (10). Jednak dowody epidemiologiczne na pozytywny związek między narażeniem środowiskowym na zaburzenia erekcji są ograniczone. Dwa badania wykorzystujące osocze krwi lub tłuszcz brzuszny do monitorowania trwałych zanieczyszczeń wykazały pozytywny związek z ryzykiem PCa (transchlordan, beta-heksachlorocykloheksan, trans-nonachlor, dieldryna i polichlorowany bifenyl 153) (11, 12). Niedawne badanie przeprowadzone we francuskich Indiach Zachodnich wykazało, że chlordekon, pestycyd chloroorganiczny o dobrze zdefiniowanych właściwościach estrogennych, zwiększa ryzyko PCa i jest związany z agresywną postacią choroby u osób z dodatnim wywiadem rodzinnym w kierunku PCa (13) .

Skład WAT: Lipidom. Wśród składników odżywczych, lipidy dietetyczne są głównymi determinantami ogólnego składu lipidów WAT, jak oceniono podczas badań interwencji dietetycznej (19-22). Wśród kwasów tłuszczowych niezbędne wielonienasycone kwasy tłuszczowe (PUFA) stanowią podklasę składników bioaktywnych podzielonych na dwie grupy: kwasy tłuszczowe n-6 i n-3. Seria n-6 obejmuje prekursorowy kwas linolowy (LA, 18:2n-6). Seria n-3 obejmuje prekursor kwasu alfa-linolenowego (ALA, 18:3n-3) i wysoce nienasycone pochodne. Wykazano, że skład kwasów tłuszczowych WAT odzwierciedla wcześniejsze spożycie kwasów tłuszczowych (23). Chociaż nie ma rozstrzygających badań wykazujących związek między całkowitym spożyciem tłuszczu w diecie a ryzykiem PCa, określone rodzaje tłuszczu w diecie (tłuszcz zwierzęcy) wydają się być bardziej znaczące w zwiększaniu ryzyka PCa (6, 28). Związek między spożywaniem ryb (bogatych w długołańcuchowe PUFA omega-3) a niższym ryzykiem raka prostaty jest kontrowersyjny, ale opisano znaczące zmniejszenie śmiertelności związanej z rakiem prostaty (29). Wcześniejsze badania analizujące skład PUFA w tkankach prostaty prowadziły do ​​sprzecznych wyników. Jednak skład kwasów tłuszczowych WAT nigdy nie był badany w PCa w związku z agresywnością i progresją.

Celem programu jest stworzenie sieci zrzeszającej klinicystów, patologów i naukowców zajmujących się zarządzaniem i badaniami nad rakiem prostaty. Sieć wygeneruje wieloośrodkową, scentralizowaną bazę danych pacjentów z rakiem stercza, leczonych metodą radykalnej prostatektomii, ze znormalizowanym gromadzeniem biozasobów, w tym próbek prostaty i tkanki tłuszczowej. Wykorzystanie biozasobów będzie ukierunkowane głównie na związki między tkanką tłuszczową/lipidami a agresywnością PCa.

Projekt ma na celu scharakteryzowanie związku między agresywnością PCa a składem tkanki tłuszczowej miednicy. Próbki tkanki tłuszczowej od pacjentów z niskim ryzykiem (n=100) lub agresywnym (n=100) RGK będą analizowane pod kątem 1/ profilu lipidowego (skład kwasów tłuszczowych i proporcje fosfolipidów), 2/ ekspresji adipokin oraz 3/ przetrwałych zanieczyszczenia organiczne o działaniu podobnym do hormonów. W analizie uwzględnione zostaną znane czynniki agresywności, w tym otyłość, składowe MetS, pochodzenie etniczno-geograficzne oraz dodatni wywiad rodzinny w kierunku tej choroby.

Wdrożona metodologia i techniki I- Budowa bazy danych i gromadzenie biozasobów Do kohorty zostanie włączony każdy pacjent z rakiem prostaty leczony metodą radykalnej prostatektomii w 7 ośrodkach klinicznych sieci. Biorąc pod uwagę działalność chirurgiczną tych ośrodków w ciągu ostatnich 3 lat, oczekuje się co najmniej 1000 inkluzji po 18 miesiącach, z około 250 pacjentami z Afryki i Karaibów. Standaryzowane dane kliniczne, biologiczne i patologiczne zostaną wprowadzone do wspólnego scentralizowanego eCRF dostępnego w każde centrum (Clinsight®) z centralnym zarządzaniem i walidacją (zespół 13). Wsparcie finansowe otrzymają zespoły kliniczne wprowadzające dane (technicy specjalizujący się w badaniach klinicznych).

Do bazy danych zostaną wprowadzone dane powszechnie związane z PCa: elementy administracyjne (nazwa, data urodzenia, adres, nr szpitala, nr patologii), przedoperacyjny PSA, stopień kliniczny, elementy patologiczne (waga i wielkość próbki, stopień zaawansowania patologicznego, w tym stan węzłów chłonnych, wynik Gleasona, % stopnia 4 lub 5, większa oś ogniska głównego, stan marginesu) oraz elementy kontrolne (zarówno biologiczne, jak i kliniczne). Określone zostaną również następujące elementy: BMI, obwód talii, glikemię na czczo, ciśnienie krwi, lipidy krążące (trójglicerydy, cholesterol całkowity, LDL i HDL), trwające leczenie (leki obniżające poziom lipidów, HTA, leczenie cukrzycy), pochodzenie etnogeograficzne, wywiad rodzinny w kierunku RGK W trakcie zabiegów chirurgicznych 3 szt. tkanki tłuszczowej miednicy (około 5 g, 2 g i 2 g, odpowiednio dla zadań 1, 2 i 3 osi 1) zostanie pobrana próbka, wysłana do centrum zasobów biologicznych i natychmiast zamrożona w temperaturze -80°C. Badacze zdecydowali się pobrać próbki trzewnej WAT zamiast podskórnej WAT, ponieważ adipocyty trzewne są bardziej aktywne metabolicznie (8). Spośród WAT trzewnych badacze wybierają okołopęcherzową tkankę tłuszczową, ponieważ tłuszcz wokół pęcherza moczowego jest zawsze bardzo obfity i można go łatwo pobrać podczas zabiegu chirurgicznego. Próbki gruczołu krokowego zostaną natychmiast wysłane do oddziałów patologii i poddane standardowej obróbce.

Pacjenci włączeni do kohorty zostaną poproszeni o podpisanie świadomej zgody (po uzyskaniu zgody Komisji Etycznej/IRB). Opatrzone adnotacjami biozasoby dotyczące tematów objętych programami będą zarządzane z poszanowaniem zasad określonych przez CNIL.

Wybór pacjentów z chorobą agresywną lub chorobą niskiego ryzyka z kohorty spośród 1000 pacjentów spodziewanych w M18, wybranych zostanie 100 pacjentów z chorobą wysoce agresywną. Selekcja zostanie przeprowadzona na podstawie kryteriów choroby wysokiego ryzyka, głównie PCa wysokiego stopnia (8 punktów w skali Gleasona lub więcej) i/lub stadium patologicznego pT3. Każdy z tych 100 pacjentów zostanie następnie dopasowany (od środka do środka) z 1 pacjentem z łagodną chorobą i identycznym statusem dla wieku (50 lub mniej, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70, 71-75, powyżej 75 roku życia) i BMI (normalny, z nadwagą i otyłością). Kryteria łagodnej choroby obejmują przedoperacyjne stężenie PSA < 10 ng/ml, punktację Gleasona 6 lub niższą (na próbce chirurgicznej) oraz stadium pT2. Jeśli kilka łagodnych przypadków można dopasować do 1 agresywnego przypadku, preferowany będzie ten z mniejszym rozmiarem guza. Wykorzystana zostanie tkanka tłuszczowa pobrana od tych 200 pacjentów.

Celem jest identyfikacja związków między agresywnym i istotnym rakiem stercza a składem tkanki tłuszczowej. Badacze wysuwają hipotezę, że trwałe zanieczyszczenia organiczne (które odzwierciedlają skumulowaną ekspozycję w przeszłości) i/lub skład lipidów (które odzwierciedlają spożycie w przeszłości) mogą, wraz z ekspresją adipokin, być związane z agresywnością choroby. Uwzględnione zostaną znane czynniki agresywności PCa (pochodzenie etniczne, wywiad rodzinny i otyłość).

Zadanie 1: Analiza lipidomu Analizy przeprowadzone na próbkach tkanki tłuszczowej będą dotyczyć: i) składu triglicerydów kwasów tłuszczowych oraz ii) względnych ilości klas fosfolipidów błonowych komórek tłuszczowych. Pięć głównych klas fosfolipidów występujących w błonie komórkowej komórek tłuszczowych można rozdzielić i oznaczyć ilościowo: fosfatydylocholina, fosfatydyloetanoloamina, fosfatydyloinozytol, fosfatydyloseryna i sfingomielina. Ponieważ tkanka tłuszczowa składa się głównie z triacylogliceroli i tylko około 1% fosfolipidów, badanie fosfolipidów błonowych będzie wymagało większych ilości próbek (5 g) niż byłoby to zwykle konieczne do analizy składu triglicerydów i kwasów tłuszczowych (400-500 mg).

Próbki tkanki tłuszczowej zostaną poddane ekstrakcji lipidów chloroformem i metanolem (według metody Folcha). Pokrótce, cały ekstrakt zostanie wysuszony pod próżnią, a następnie ponownie rozpuszczony w mieszaninie heksanu i metanolu w celu rozdzielenia lipidów obojętnych (rozpuszczalnych w heksanie) i polarnych (rozpuszczalnych w metanolu). Triglicerydy w fazie heksanowej będą dalej oczyszczane z innych obojętnych lub polarnych lipidów metodą chromatografii cienkowarstwowej na płytkach z żelem krzemionkowym. Oczyszczone triglicerydy zostaną poddane transestryfikacji metanolem w celu wytworzenia lotnych kwasów tłuszczowych w postaci estrów metylowych. Rozdział i oznaczenie ilościowe kwasów tłuszczowych zostanie przeprowadzone metodą chromatografii gazowej (fazowa kolumna kapilarna BPX-70, nastrzyk na kolumnę, detektor płomieniowo-jonizacyjny).

Zadanie 2: Pomiary adipokin Całkowity RNA z próbek tkanki tłuszczowej zostanie wyekstrahowany techniką Trizol, a jakość RNA zostanie sprawdzona za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i oznaczenia ilościowego za pomocą NanoDrop. Po odwrotnej transkrypcji kodującego mRNA do cDNA, kontrola jakości amplifikacji PCR z odwrotną transkrypcją zostanie przeprowadzona przy użyciu genu podstawowego w małej liczbie cykli i nowej kontroli na żelu agarozowym. Ilościowa PCR w czasie rzeczywistym zostanie następnie przeprowadzona w trzech powtórzeniach na dziewięciu genach będących przedmiotem zainteresowania (adipokinach) i trzech genach podstawowych do normalizacji (18S, beta-aktyna i SDHA), tj. wygenerowanych 10 800 punktów. PCR zostaną wykonane na 384-dołkowych płytkach, a mieszaniny reakcyjne zostaną rozprowadzone przez roboty. Lista adipokin (n=9): chemeryna, interleukina-6 (IL-6), inhibitor aktywatora plazminogenu-1 (PAI-1), wiązanie retinolu białko 4 (RBP4), czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF alfa), wisfatyna, leptyna, adiponektyna, apelina.

Zadanie 3: Pomiary trwałych zanieczyszczeń organicznych (pestycydów chloroorganicznych) Metodologia analityczna zastosowana do pomiaru docelowych pestycydów chloroorganicznych wywodzi się z procedur wcześniej opracowanych, zatwierdzonych i akredytowanych dla innych klas lipofilowych trwałych zanieczyszczeń organicznych, takich jak dioksyny i związki PCB. W skrócie, po wstępnym etapie z wykorzystaniem przyspieszonej ekstrakcji rozpuszczalnikowej (ASE) nastąpią kolejne etapy oczyszczania na kolumnach z aktywowaną krzemionką i celitem. Pomiar zostanie przeprowadzony z wykorzystaniem chromatografii gazowej sprzężonej z wysokorozdzielczą i/lub tandemową spektrometrią mas (GC-HRMS, GC-MS/MS). Oznaczenie ilościowe zostanie przeprowadzone zgodnie z metodą rozcieńczeń izotopowych (tj. przy użyciu 13C znakowanego analogicznie do wzorców wewnętrznych). Wybór głównych substancji docelowych zostanie dokonany wstępnie w oparciu o konwencję sztokholmską, która wymienia około 12 głównych pestycydów budzących obawy.

Wieloośrodkowa standaryzowana kliniczna i biologiczna baza danych zidentyfikuje 2 jednorodne grupy pacjentów z rakiem stercza o charakterystyce choroby agresywnej lub potencjalnie powolnej. Badacze spodziewają się, że analiza tkanki tłuszczowej miednicy wykaże, czy niektóre kategorie 1/ lipidów (odzwierciedlających dietę), 2/ adipokin i 3/ zmagazynowanych ksenobiotyków są preferencyjnie związane z większym lub mniejszym ryzykiem agresywności PCa. Taka identyfikacja może następnie prowadzić do strategii zapobiegawczych.