Rete strutturale sul cancro alla prostata nella regione del Grande Ovest francese (RESCAP)

Rilevanza e approccio strategico Il cancro alla prostata (PCa) è il tumore più comune negli uomini e la seconda causa di morte per cancro nei paesi occidentali. I fattori di rischio noti sono l'età avanzata, le origini etniche e l'anamnesi familiare positiva per la malattia (1). Esistono notevoli disparità etniche nel rischio di PCa, con un tasso di incidenza superiore del 60% tra gli uomini afroamericani (AA) rispetto agli uomini europei-americani (EA) (2). Allo stesso modo, nelle Antille francesi, dove almeno il 90% degli abitanti è di origine africana, l'incidenza di PCa è doppia rispetto al resto della Francia (3). Molti stili di vita, fattori di rischio ambientali e professionali tra cui obesità, dieta, farmaci e pesticidi sono stati implicati nell'eziologia del PCa, ma i loro ruoli rimangono poco chiari (4). La ricerca attuale suggerisce che esiste una complessa interazione di fattori genetici e ambientali che hanno un ruolo causale nel PCa.

PCa ha anche un potenziale di evoluzione altamente eterogeneo. Mentre alcuni tumori si comporteranno in modo aggressivo, altri pazienti avranno una forma indolente della malattia che non potrebbe richiedere alcun trattamento. Diversi parametri vengono utilizzati per prevedere il rischio di evoluzione nei pazienti con PCa, sia prima di qualsiasi trattamento: stadio clinico, punteggio di Gleason sulle biopsie e antigene prostatico specifico sierico (PSA), sia dopo l'analisi dei campioni di prostatectomia radicale: stadio patologico e Gleason chirurgico punteggio (5). Tuttavia, nonostante il valore di questi fattori prognostici, il potenziale di aggressività rimane difficile da valutare alla diagnosi e i pazienti classificati nel gruppo a rischio intermedio sono spesso difficili da gestire.

Entrambi i fattori genetici e ambientali sono stati collegati al rischio di malattia aggressiva. È probabile che l'origine etnica svolga un ruolo, poiché la proporzione di casi diagnosticati allo stadio metastatico risulta essere più alta per i pazienti afroamericani (35%) che per i pazienti europeo-americani (22%), con un aumento di 2,4 volte tasso di mortalità più elevato negli uomini AA rispetto agli uomini EA (2). Insieme ai fattori genetici, anche i fattori ambientali sembrano svolgere un ruolo chiave nella progressione del PCa. Alcuni fattori ambientali come l'obesità sono stati associati a PCa aggressivo (6). Tuttavia, resta ancora molto da cercare sul ruolo dei fattori genetici e ambientali e sulla loro interazione nell'aggressività del PCa. Il tessuto adiposo bianco (WAT) ei lipidi sono potenzialmente coinvolti nello sviluppo e/o nella progressione del PCa a molti livelli.

WAT è un organo endocrino metabolicamente attivo. Gli adipociti secernono una varietà di ormoni, peptidi bioattivi e citochine, chiamati adipochine (9). Diverse adipochine sono state coinvolte nei meccanismi che portano alla progressione e all'aggressività del PCa, tra cui la leptina, l'interleuchina IL-6 e il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF).

Stoccaggio di interferenti endocrini. Si ritiene che gli interferenti endocrini (DE) siano coinvolti nel cancro alla prostata (10). Tuttavia, le prove epidemiologiche di un legame positivo tra le esposizioni ambientali alla disfunzione erettile sono limitate. Due studi che hanno utilizzato il plasma sanguigno o il grasso addominale per monitorare gli inquinanti persistenti hanno mostrato associazioni positive con il rischio di PCa (transclordano, beta-esaclorocicloesano, trans-nonacloro, dieldrina e policlorobifenile 153) (11, 12). Un recente studio condotto nelle Antille francesi ha mostrato che il clordecone, un pesticida organoclorurato con proprietà estrogeniche ben definite, aumenta il rischio di PCa, ed è associato a una forma aggressiva della malattia in soggetti con una storia familiare positiva di PCa (13) .

Composizione WAT: Lipidome. Tra i nutrienti, i lipidi alimentari sono i principali determinanti della composizione lipidica complessiva del WAT, come valutato durante gli studi di intervento dietetico (19-22). Tra gli acidi grassi, gli acidi grassi polinsaturi essenziali (PUFA) sono una sottoclasse di componenti bioattivi divisi in due gruppi, acidi grassi n-6 e n-3. La serie n-6 include il precursore dell'acido linoleico (LA, 18:2n-6). La serie n-3 include il precursore dell'acido alfa-linolenico (ALA, 18:3n-3) e derivati ​​altamente insaturi. È stato dimostrato che la composizione degli acidi grassi del WAT riflette l'assunzione passata di acidi grassi (23). Sebbene non vi siano studi conclusivi che mostrino un'associazione tra l'assunzione totale di grassi nella dieta e il rischio di PCa, tipi specifici di grassi alimentari (grassi animali) sembrano essere più significativi nell'aumentare il rischio di PCa (6, 28). L'associazione tra consumo di pesce (ricco di PUFA omega-3 a catena lunga) e minor rischio di cancro alla prostata è controversa, ma è stata descritta una significativa riduzione della mortalità specifica per cancro alla prostata (29). Precedenti studi che analizzavano la composizione dei PUFA nei tessuti della prostata hanno portato a risultati contrastanti. Tuttavia, la composizione degli acidi grassi del WAT non è mai stata studiata nel PCa in associazione con l'aggressività e la progressione.

L'obiettivo del programma è quello di strutturare una rete che associ medici, patologi e scienziati dediti alla gestione e alla ricerca sul cancro alla prostata. La rete genererà un database centralizzato multicentrico di pazienti affetti da PCa trattati con prostatectomia radicale, con raccolta standardizzata di risorse biologiche, inclusi campioni di prostata e tessuto adiposo. L'utilizzo delle biorisorse sarà orientato principalmente verso le relazioni tra tessuto adiposo/lipidi e aggressività del PCa.

Il progetto mira a caratterizzare un'associazione tra l'aggressività del PCa e la composizione del tessuto adiposo pelvico. Campioni di tessuto adiposo di pazienti con PCa a basso rischio (n=100) o aggressivo (n=100) saranno analizzati per 1/ profilo lipidico (composizione in acidi grassi e proporzioni di fosfolipidi), 2/ espressione di adipochine e 3/ persistente inquinanti organici con attività ormonale. L'analisi terrà conto di fattori noti di aggressività, tra cui obesità, componenti MetS, origine etno-geografica e storia familiare positiva della malattia.

Metodologia e tecniche implementate I- Costituzione del database e raccolta delle bio-risorse Verrà inserito nella coorte ogni paziente affetto da carcinoma della prostata trattato con prostatectomia radicale nei 7 centri clinici della rete. Data l'attività chirurgica di questi centri negli ultimi 3 anni, si prevede un minimo di 1000 inclusioni dopo 18 mesi, con circa 250 pazienti afro-caraibici. I dati clinici, biologici e patologici standardizzati saranno inseriti in una comune eCRF centralizzata disponibile in ogni centro (Clinsight®) con gestione e convalida centralizzata (Team 13). Verrà fornito un supporto finanziario alle équipe cliniche per l'inserimento dei dati (tecnici specializzati nella ricerca clinica).

Verranno inseriti nel database i dati comunemente associati al PCa: item amministrativi (nome, data di nascita, indirizzo, N° Ospedale, N° Patologia), PSA preoperatorio, stadio clinico, item patologici (peso e dimensione del campione, stadio patologico compreso stato dei linfonodi, punteggio di Gleason, % di grado 4 o 5, asse maggiore del focus principale, stato dei margini) e elementi di follow-up (sia biologici che clinici). Verranno inoltre specificati i seguenti elementi: BMI, circonferenza della vita, glicemia a digiuno, pressione sanguigna, lipidi circolanti (trigliceridi, colesterolo totale, LDL e HDL), trattamenti in corso (farmaci ipolipemizzanti, HTA, trattamenti per il diabete), origine etnogeografica e storia familiare di PCa Durante le procedure chirurgiche, 3 pezzi di tessuto adiposo pelvico (circa 5g, 2g e 2 g, rispettivamente per i compiti 1, 2 e 3 dell'Asse 1) sarà prelevato, inviato al centro risorse biologiche e immediatamente congelato a -80°C. I ricercatori scelgono di campionare il WAT viscerale invece del WAT sottocutaneo, perché gli adipociti viscerali sono più metabolicamente attivi (8). Tra i WAT viscerali, i ricercatori scelgono di campionare il tessuto adiposo perivescicale, poiché il grasso attorno alla vescica è sempre molto abbondante e può essere facilmente prelevato durante la procedura chirurgica. I campioni di prostata saranno inviati immediatamente ai reparti di patologia, e gestiti in maniera standardizzata.

Ai pazienti inclusi nella coorte verrà chiesto di firmare un consenso informato (previo accordo del Comitato Etico/IRB). Le bio-risorse commentate relative ai temi inseriti nei programmi saranno gestite nel rispetto delle regole definite dalla CNIL.

Selezione di pazienti con malattia aggressiva o a basso rischio dalla coorte tra i 1000 pazienti attesi a M18, saranno selezionati 100 pazienti con malattia altamente aggressiva. La selezione sarà effettuata sulla base dei criteri di malattia ad alto rischio, principalmente PCa di alto grado (punteggio di Gleason 8 o più) e/o stadio patologico pT3. Ciascuno di questi 100 pazienti verrà quindi abbinato (centro per centro) a 1 paziente con malattia indolente e stato identico per età (50 o meno, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70, 71-75, più di 75 anni) e BMI (normale, sovrappeso e obeso). I criteri per la malattia indolente includeranno PSA preoperatorio < 10 ng/ml e punteggio di Gleason 6 o inferiore (sul campione chirurgico) e stadio pT2. Se diversi casi indolenti possono essere abbinati a 1 caso aggressivo, sarà preferito quello con la dimensione del tumore più piccola. Verrà utilizzato il tessuto adiposo prelevato da questi 200 pazienti.

L'obiettivo è identificare le associazioni tra PCa aggressivo e significativo e la composizione del tessuto adiposo. I ricercatori ipotizzano che gli inquinanti organici persistenti (che riflettono l'esposizione cumulativa passata) e/o la composizione lipidica (che riflette l'assunzione passata), potrebbero essere, insieme all'espressione di adipochine, associati all'aggressività della malattia. Saranno presi in considerazione fattori noti di aggressività del PCa (origine etnica, storia familiare e stato di obesità).

Task1: Analisi del lipidoma Le analisi eseguite sui campioni di tessuto adiposo saranno: i) la composizione in acidi grassi dei trigliceridi, e ii) le quantità relative delle classi di fosfolipidi di membrana delle cellule adipose. È possibile separare e quantificare cinque classi principali di fosfolipidi presenti nella membrana plasmatica delle cellule adipose: fosfatidilcolina, fosfatidiletanolammina, fosfatidilinositolo, fosfatidilserina e sfingomielina. Essendo il tessuto adiposo composto principalmente da triacilglicerolo e solo circa l'1% di fosfolipidi, lo studio dei fosfolipidi di membrana richiederà quantità di campione maggiori (5 g) rispetto a quelle normalmente necessarie per l'analisi della composizione degli acidi grassi dei trigliceridi (400-500 mg).

I campioni di tessuto adiposo saranno sottoposti ad estrazione lipidica con l'utilizzo di cloroformio e metanolo (secondo il metodo Folch). In breve, l'estratto totale sarà essiccato sotto vuoto, quindi risolubilizzato in una miscela di esano e metanolo per separare i lipidi neutri (solubili in esano) e polari (solubili in metanolo). I trigliceridi nella fase esanica saranno ulteriormente purificati da altri lipidi neutri o polari mediante cromatografia su strato sottile su lastre di gel di silice. I trigliceridi purificati subiranno la transesterificazione del metanolo per produrre acidi grassi volatili come esteri metilici. La separazione e la quantificazione degli acidi grassi sarà effettuata mediante gascromatografia (colonna capillare in fase BPX-70, iniezione in colonna, rivelatore a ionizzazione di fiamma).

Task2: Misurazione delle adipochine L'RNA totale da campioni di tessuto adiposo sarà estratto mediante la tecnica Trizol e la qualità dell'RNA sarà controllata mediante elettroforesi su gel agarosio e quantificazione mediante NanoDrop. Dopo la trascrizione inversa dell'mRNA codificante in cDNA, la qualità del controllo dell'amplificazione PCR della trascrizione inversa sarà eseguita utilizzando un gene housekeeping nel basso numero di cicli e un nuovo controllo mediante gel agarosio. La PCR quantitativa in tempo reale sarà quindi eseguita in triplicato su nove geni di interesse (adipochine) e tre geni housekeeping per la normalizzazione (18S, beta-actina e SDHA), ovvero 10 800 punti generati. Le PCR saranno effettuate in piastre da 384 pozzetti e le miscele di reazione distribuite mediante distribuzione robotica. Elenco delle adipochine (n=9): chemerina, interleuchina-6 (IL-6), inibitore dell'attivatore del plasminogeno-1 (PAI-1), legame del retinolo proteina 4 (RBP4), fattore di necrosi tumorale alfa (TNF alfa), visfatina, leptina, adiponectina, apelina.

Task3: Misurazione degli inquinanti organici persistenti (pesticidi organoclorurati) La metodologia analitica utilizzata per misurare i pesticidi organoclorinati mirati deriva da procedure precedentemente sviluppate, convalidate e accreditate per altre classi di inquinanti organici persistenti lipofili come diossine e composti PCB. In breve, una fase preliminare che utilizza l'estrazione accelerata con solvente (ASE) sarà seguita da successivi stadi di purificazione su colonne di silice attivata e celite. La misura sarà effettuata mediante gascromatografia accoppiata a spettrometria di massa ad alta risoluzione e/o tandem (GC-HRMS, GC-MS/MS). La quantificazione sarà ottenuta secondo il metodo della diluizione isotopica (cioè utilizzando 13C marcati analoghi come standard interni). La selezione delle principali sostanze mirate sarà preliminare sulla base della convenzione di Stoccolma che elenca circa 12 principali pesticidi preoccupanti.

Il database clinico e biologico standardizzato multicentrico identificherà 2 gruppi omogenei di pazienti affetti da PCa con caratteristiche di malattia aggressiva o potenzialmente indolente. I ricercatori si aspettano che l'analisi del tessuto adiposo pelvico dimostri se alcune categorie di 1/ Lipidi (che riflettono la dieta), 2/ Adipochine e 3/ Xenobiotici immagazzinati sono preferenzialmente associate a un rischio maggiore o minore di aggressività del PCa. Tale identificazione potrebbe quindi portare a strategie preventive.