Rede Estrutural sobre Câncer de Próstata na Região do Grande Oeste Francês (RESCAP)

Relevância e abordagem estratégica O câncer de próstata (CaP) é o câncer mais comum em homens e a segunda principal causa de morte por câncer nos países ocidentais. Os fatores de risco conhecidos são idade avançada, origens étnicas e história familiar positiva da doença (1). Existem disparidades étnicas consideráveis ​​no risco de CaP, com uma taxa de incidência 60% maior entre homens afro-americanos (AA) em comparação com homens europeus-americanos (EA) (2). Da mesma forma, nas Índias Ocidentais Francesas, onde pelo menos 90% dos habitantes são descendentes de africanos, a incidência de CaP é duas vezes maior do que no restante da França (3). Muitos estilos de vida, fatores de risco ambientais e ocupacionais, incluindo obesidade, dieta, medicamentos e pesticidas, foram implicados na etiologia do CaP, mas seus papéis permanecem obscuros (4). A pesquisa atual sugere que existe uma interação complexa de fatores genéticos e ambientais que têm um papel causal no CaP.

O PCa também tem um potencial altamente heterogêneo de evolução. Embora alguns tipos de câncer se comportem de maneira agressiva, outros pacientes terão uma forma indolente da doença que pode não exigir nenhum tratamento. Vários parâmetros são usados ​​para prever o risco de evolução em pacientes com CaP, seja antes de qualquer tratamento: estágio clínico, escore de Gleason em biópsias e antígeno prostático específico (PSA) sérico, ou após a análise de amostras de prostatectomia radical: estágio patológico e Gleason cirúrgico pontuação (5). No entanto, apesar do valor desses fatores prognósticos, o potencial de agressividade permanece difícil de avaliar no diagnóstico, e os pacientes classificados no grupo de risco intermediário são frequentemente difíceis de manejar. Há um desafio para descobrir novos marcadores e novos alvos para manipulação terapêutica precoce.

Ambos os fatores genéticos e ambientais têm sido associados ao risco de doença agressiva. É provável que a origem étnica desempenhe um papel, uma vez que a proporção de casos diagnosticados no estágio metastático é maior em pacientes afro-americanos (35%) do que em europeus-americanos (22%), com 2,4 vezes mais maior taxa de mortalidade em homens com AA do que em homens com EA (2). Juntamente com os fatores genéticos, os fatores ambientais também parecem desempenhar um papel fundamental na progressão do CaP. Alguns fatores ambientais, como a obesidade, têm sido associados ao CaP agressivo (6). No entanto, ainda há muito a pesquisar sobre o papel dos fatores genéticos e ambientais e sua interação na agressividade do CaP. O tecido adiposo branco (WAT) e os lipídios estão potencialmente envolvidos no desenvolvimento e/ou progressão do CaP em muitos níveis.

WAT é um órgão endócrino metabolicamente ativo. Os adipócitos secretam uma variedade de hormônios, peptídeos bioativos e citocinas, denominadas adipocinas (9). Várias adipocinas têm sido envolvidas nos mecanismos que levam à progressão e agressividade do CaP, incluindo a leptina, a interleucina IL-6 e o ​​fator de crescimento endotelial vascular (VEGF).

Armazenamento de disruptores endócrinos. Acredita-se que os disruptores endócrinos (DE) estejam envolvidos no câncer de próstata (10). No entanto, a evidência epidemiológica de uma ligação positiva entre exposições ambientais a DE é limitada. Dois estudos usando plasma sanguíneo ou gordura abdominal para monitorar poluentes persistentes mostraram associações positivas com o risco de PCa (transclordano, beta-hexaclorociclohexano, trans-nonacloro, dieldrina e bifenil policlorado 153) (11, 12). Um estudo recente realizado nas Índias Ocidentais Francesas mostrou que a clordecona, um pesticida organoclorado com propriedades estrogênicas bem definidas, aumenta o risco de CaP e está associada a uma forma agressiva da doença em indivíduos com história familiar positiva de CaP (13) .

WAT composição: Lipidome. Entre os nutrientes, os lipídios dietéticos são os principais determinantes da composição lipídica geral do WAT, conforme avaliado durante os estudos de intervenção dietética (19-22). Dentre os ácidos graxos, os ácidos graxos poliinsaturados essenciais (PUFAs) são uma subclasse de componentes bioativos divididos em dois grupos, ácidos graxos n-6 e n-3. A série n-6 inclui o precursor ácido linoleico (LA, 18:2n-6). A série n-3 inclui o precursor ácido alfa-linolênico (ALA, 18:3n-3) e derivados altamente insaturados. A composição de ácidos graxos do WAT demonstrou refletir a ingestão anterior de ácidos graxos (23). Embora não haja estudos conclusivos mostrando uma associação entre a ingestão total de gordura na dieta e o risco de CaP, tipos específicos de gordura na dieta (gordura animal) parecem ser mais significativos no aumento do risco de CaP (6, 28). A associação entre o consumo de peixe (rico em PUFAs ômega-3 de cadeia longa) e menor risco de câncer de próstata é controversa, mas uma redução significativa na mortalidade específica do câncer de próstata foi descrita (29). Estudos anteriores analisando a composição dos PUFAs nos tecidos da próstata levaram a resultados conflitantes. No entanto, a composição de ácidos graxos do WAT nunca foi estudada em CaP em associação com agressividade e progressão.

O objetivo do programa é estruturar uma rede associando médicos, patologistas e cientistas dedicados ao tratamento e pesquisa do câncer de próstata. A rede gerará um banco de dados centralizado multicêntrico de pacientes com CaP tratados por prostatectomia radical, com coleta padronizada de recursos biológicos, incluindo amostras de tecido adiposo e próstata. A utilização dos biorrecursos será orientada principalmente para as relações entre tecido adiposo/lipídeos e agressividade do CaP.

O projeto visa caracterizar uma associação entre a agressividade do CaP e a composição do tecido adiposo pélvico. Amostras de tecido adiposo de pacientes com PCa de baixo risco (n=100) ou agressivo (n=100) serão analisadas para 1/ o perfil lipídico (composição de ácidos graxos e proporções de fosfolipídios), 2/ expressão de adipocinas e 3/ persistente poluentes orgânicos com atividade semelhante a hormônio. A análise levará em conta fatores conhecidos de agressividade, incluindo obesidade, componentes da SM, origem etnogeográfica e história familiar positiva da doença.

Metodologia e técnicas implementadas I- Constituição do banco de dados e coleta de biorrecursos Cada paciente com câncer de próstata tratado por prostatectomia radical nos 7 centros clínicos da rede será incluído na coorte. Dada a atividade cirúrgica desses centros durante os últimos 3 anos, espera-se um mínimo de 1.000 inclusões após 18 meses, com cerca de 250 pacientes afro-caribenhos. Dados clínicos, biológicos e patológicos padronizados serão inseridos em um eCRF centralizado comum disponível em cada centro (Clinsight®) com gestão e validação central (Team 13). Será disponibilizado apoio financeiro às equipas clínicas para introdução dos dados (técnicos especializados em investigação clínica).

Os dados comumente associados ao CaP serão inseridos no banco de dados: itens administrativos (nome, DOB, endereço, Hospital N°, Patologia N°), PSA pré-operatório, estágio clínico, itens patológicos (peso e tamanho da amostra, estágio patológico incluindo estado linfonodal, escore de Gleason, % de grau 4 ou 5, maior eixo do foco principal, estado de margem) e itens de acompanhamento (tanto biológico quanto clínico). Os seguintes itens também serão especificados: IMC, circunferência da cintura, glicemia de jejum, pressão arterial, lipídios circulantes (triglicerídeos, colesterol total, LDL e HDL), tratamentos em andamento (hiperlipemiantes, HTA, tratamentos para diabetes), origem etnogeográfica e história familiar de CaP Durante os procedimentos cirúrgicos, 3 peças de tecido adiposo pélvico (em torno de 5g, 2g e 2g, para as tarefas 1, 2 e 3 do Eixo 1, respectivamente) serão amostrados, enviados ao centro de recursos biológicos e imediatamente congelados a -80°C. Os investigadores optam por amostrar WAT visceral em vez de WAT subcutâneo, porque os adipócitos viscerais são metabolicamente mais ativos (8). Entre os WAT viscerais, os investigadores optam por amostras de tecido adiposo perivesical, uma vez que a gordura ao redor da bexiga é sempre muito abundante e pode ser facilmente retirada durante o procedimento cirúrgico. As amostras de próstata serão enviadas imediatamente para os departamentos de patologia e tratadas de maneira padronizada.

Os pacientes incluídos na coorte serão solicitados a assinar um termo de consentimento informado (após concordância do Comitê de Ética/CIR). Os bio-recursos anotados relativos às disciplinas incluídas nos programas serão geridos respeitando as regras definidas pela CNIL.

Seleção de pacientes com doença agressiva ou de baixo risco da coorte dos 1.000 pacientes esperados em M18, 100 pacientes com doença altamente agressiva serão selecionados. A seleção será feita com base nos critérios de doença de alto risco, principalmente PCa de alto grau (escore de Gleason 8 ou mais) e/ou estágio patológico pT3. Cada um desses 100 pacientes será pareado (centro a centro) com 1 paciente com doença indolente e status idêntico para idade (50 ou menos, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70, 71-75, mais de 75 anos) e IMC (normal, sobrepeso e obesidade). Os critérios para doença indolente incluirão PSA pré-operatório < 10ng/ml, escore de Gleason 6 ou menos (no espécime cirúrgico) e estágio pT2. Se vários casos indolentes puderem ser combinados com 1 caso agressivo, aquele com tamanho de tumor menor será o preferido. O tecido adiposo amostrado desses 200 pacientes será usado.

O objetivo é identificar associações entre o CaP agressivo e significativo e a composição do tecido adiposo. Os investigadores levantam a hipótese de que os poluentes orgânicos persistentes (que refletem a exposição cumulativa passada) e/ou a composição lipídica (que refletem a ingestão passada) podem estar, juntamente com a expressão de adipocinas, associados à agressividade da doença. Fatores conhecidos de agressividade do CaP (origem étnica, história familiar e condição de obesidade) serão levados em consideração.

Tarefa 1: Análise de lipidoma As análises realizadas nas amostras de tecido adiposo serão: i) composição de triglicerídeos de ácidos graxos e ii) quantidades relativas de classes de fosfolipídios de membrana de células adiposas. Cinco grandes classes de fosfolipídios encontrados na membrana plasmática das células adiposas podem ser separadas e quantificadas: fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina e esfingomielina. Sendo o tecido adiposo composto principalmente de triacilglicerol e apenas aproximadamente 1% de fosfolipídios, o estudo dos fosfolipídios da membrana exigirá quantidades de amostra maiores (5 g) do que normalmente seria necessário para a análise da composição de triglicerídeos de ácidos graxos (400-500 mg).

Amostras de tecido adiposo serão submetidas à extração de lipídios com o uso de clorofórmio e metanol (segundo o método de Folch). Resumidamente, o extrato total será seco a vácuo, então resolubilizado em uma mistura de hexano e metanol para partição de lipídios neutros (solúvel em hexano) e polares (solúvel em metanol). Os triglicerídeos na fase hexânica serão posteriormente purificados de outros lipídios neutros ou polares por cromatografia em camada delgada em placas de sílica-gel. Triglicerídeos purificados passarão por transesterificação de metanol para produzir ácidos graxos voláteis como ésteres metílicos. A separação e quantificação dos ácidos graxos serão realizadas por cromatografia gasosa (coluna capilar de fase BPX-70, injeção on-column, detector de ionização de chama).

Tarefa 2: Medições de adipocinas O RNA total de amostras de tecido adiposo será extraído pela técnica Trizol e a qualidade do RNA será verificada por eletroforese em gel de agarose e quantificação por NanoDrop. Após a transcrição reversa da codificação do mRNA em cDNA, o controle de qualidade da amplificação por PCR da transcrição reversa será feito utilizando um gene housekeeping no baixo número de ciclos e novo controle por gel de agarose. A PCR quantitativa em tempo real será então realizada em triplicata em nove genes de interesse (adipocinas) e três genes de manutenção para normalização (18S, beta-actina e SDHA), ou seja, 10.800 pontos gerados. As PCRs serão feitas em placas de 384 poços e as misturas de reação distribuídas por distribuição de robôs. Lista de adipocinas (n=9): quemerina, interleucina-6 (IL-6), inibidor do ativador de plasminogênio-1 (PAI-1), ligação de retinol proteína 4 (RBP4), fator de necrose tumoral-alfa (TNF alfa), visfatina, leptina, adiponectina, apelina.

Tarefa 3: Medições de poluentes orgânicos persistentes (pesticidas organoclorados) A metodologia analítica usada para medir os pesticidas organoclorados visados ​​é derivada de procedimentos previamente desenvolvidos, validados e acreditados para outras classes de poluentes orgânicos persistentes lipofílicos, como dioxinas e compostos de PCB. Resumidamente, uma etapa preliminar usando extração acelerada por solvente (ASE) será seguida por sucessivas etapas de purificação em colunas de sílica ativada e celite. A medição será realizada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas de alta resolução e/ou tandem (GC-HRMS, GC-MS/MS). A quantificação será realizada de acordo com o método de diluição isotópica (ou seja, usando análogos marcados com 13C como padrões internos). A seleção das principais substâncias visadas será preliminar com base na convenção de Estocolmo, que lista cerca de 12 dos principais pesticidas preocupantes.

O banco de dados clínico e biológico padronizado multicêntrico identificará 2 grupos homogêneos de pacientes com CaP com características de doença agressiva ou potencialmente indolente. Os investigadores esperam que a análise do tecido adiposo pélvico demonstre se algumas categorias de 1/ Lipídios (refletindo a dieta), 2/ Adipocinas e 3/ Xenobióticos armazenados estão preferencialmente associadas a um maior ou menor risco de agressividade do CaP. Essa identificação poderia então levar a estratégias preventivas.