Strukturelt netværk om prostatakræft i den franske Greater West Region (RESCAP)

Relevans og strategisk tilgang Prostatakræft (PCa) er den mest almindelige kræftsygdom hos mænd og den næstførende årsag til kræftdødsfald i vestlige lande. Kendte risikofaktorer er høj alder, etnisk oprindelse og positiv familiehistorie af sygdommen (1). Der er betydelige etniske forskelle i PCa-risiko, med en 60% højere forekomst blandt afroamerikanske (AA) mænd sammenlignet med europæisk-amerikanske (EA) mænd (2). Tilsvarende i De Fransk Vestindien, hvor mindst 90 % af indbyggerne er af afrikansk afstamning, er forekomsten af ​​PCa dobbelt så høj som i resten af ​​Frankrig (3). Mange livsstils-, miljø- og arbejdsrelaterede risikofaktorer, herunder fedme, kost, medicin og pesticider, er blevet impliceret i PCa-ætiologien, men deres roller er stadig uklare (4). Nuværende forskning tyder på, at der er et komplekst samspil mellem genetiske og miljømæssige faktorer, der har en årsagsrolle i PCa.

PCa har også et meget heterogent evolutionspotentiale. Mens nogle kræftformer vil opføre sig på en aggressiv måde, vil andre patienter have en indolent form af sygdommen, som ikke kunne kræve nogen behandling. Adskillige parametre bruges til at forudsige risikoen for udvikling hos PCa-patienter, enten før enhver behandling: klinisk stadium, Gleason-score på biopsier og serum prostataspecifikt antigen (PSA), eller efter analyse af radikale prostatektomiprøver: patologisk stadium og kirurgisk Gleason score (5). På trods af værdien af ​​disse prognostiske faktorer er potentialet for aggressivitet dog stadig vanskeligt at vurdere ved diagnose, og patienter, der er klassificeret inden for den mellemliggende risikogruppe, er ofte vanskelige at håndtere. Der er en udfordring at opdage nye markører og nye mål for tidlig terapeutisk manipulation.

Både genetiske og miljømæssige faktorer har været forbundet med risikoen for aggressiv sygdom. Den etniske oprindelse vil sandsynligvis spille en rolle, eftersom andelen af ​​tilfælde diagnosticeret på det metastatiske stadium rapporteres at være højere for afroamerikanske patienter (35 %) end for europæisk-amerikanske patienter (22 %), med en 2,4-fold højere dødelighed hos AA-mænd end hos EA-mænd (2). Sammen med genetiske faktorer synes miljøfaktorer også at spille en nøglerolle i PCa-progression. Nogle miljøfaktorer såsom fedme er blevet forbundet med aggressiv PCa (6). Der er dog meget tilbage at søge om rollen af ​​genetiske og miljømæssige faktorer og deres samspil i PCa-aggressivitet. Hvidt fedtvæv (WAT) og lipider er potentielt involveret i udviklingen og/eller progressionen af ​​PCa på mange niveauer.

WAT er et metabolisk aktivt endokrine organ. Adipocytter udskiller en række forskellige hormoner, bioaktive peptider og cytokiner, kaldet adipokiner (9). Adskillige adipokiner har været involveret i de mekanismer, der fører til PCa-progression og aggressivitet, herunder leptin, interleukin IL-6 og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF).

Opbevaring af hormonforstyrrende stoffer. Hormonforstyrrende stoffer (ED) menes at være involveret i prostatacancer (10). Imidlertid er epidemiologiske beviser for en positiv sammenhæng mellem miljøeksponeringer for ED begrænset. To undersøgelser med blodplasma eller abdominalt fedt til overvågning af persistente forurenende stoffer har vist positive sammenhænge med PCa-risiko (transchlordan, beta-hexachlorcyclohexan, trans-nonachlor, dieldrin og polychloreret biphenyl 153) (11, 12). En nylig undersøgelse udført i Fransk Vestindien viste, at chlordecon, et organisk klorpesticid med veldefinerede østrogene egenskaber, øger risikoen for PCa og er forbundet med en aggressiv form for sygdommen hos personer med en positiv familiehistorie med PCa (13) .

WAT sammensætning: Lipidom. Blandt næringsstoffer er lipider i kosten væsentlige determinanter for den samlede lipidsammensætning af WAT, som vurderet under diætinterventionsundersøgelser (19-22). Blandt fedtsyrer er essentielle flerumættede fedtsyrer (PUFA'er) en underklasse af bioaktive komponenter opdelt i to grupper, n-6 og n-3 fedtsyrer. n-6-serien inkluderer precursoren linolsyre (LA, 18:2n-6). n-3-serien omfatter precursoren alfa-linolensyre (ALA, 18:3n-3) og stærkt umættede derivater. Fedtsyresammensætningen af ​​WAT har vist sig at afspejle det tidligere fedtsyreindtag (23). Selvom der ikke er nogen afgørende undersøgelser, der viser en sammenhæng mellem det totale fedtindtag i kosten og PCa-risikoen, ser specifikke typer af diætfedt (animalsk fedt) ud til at være mere signifikante for at øge PCa-risikoen (6, 28). Sammenhængen mellem fiskeforbrug (rig på de langkædede omega-3 PUFA'er) og lavere risiko for prostatacancer er kontroversiel, men en signifikant reduktion i prostatacancer-specifik dødelighed er beskrevet (29). Tidligere undersøgelser, der analyserer PUFAs sammensætning i prostatavæv har ført til modstridende resultater. Fedtsyresammensætningen af ​​WAT er dog aldrig blevet undersøgt i PCa i forbindelse med aggressivitet og progression.

Målet med programmet er at strukturere et netværk, der forbinder klinikere, patologer og videnskabsmænd, der er dedikeret til behandling og forskning i prostatacancer. Netværket vil generere en multicentreret centraliseret database over PCa-patienter behandlet ved radikal prostatektomi, med standardiseret bio-ressourceindsamling, herunder prostata- og fedtvævsprøver. Brugen af ​​bioressourcerne vil primært være orienteret mod forholdet mellem fedtvæv/lipider og PCa-aggressivitet.

Projektet har til formål at karakterisere en sammenhæng mellem PCa-aggressivitet og sammensætningen af ​​bækkenfedtvæv. Fedtvævsprøver fra patienter med enten lav risiko (n=100) eller aggressiv (n=100) PCa vil blive analyseret for 1/ lipidprofilen (fedtsyresammensætning og phospholipid-forhold), 2/ ekspression af adipokiner og 3/ persistent organiske forurenende stoffer med hormonlignende aktivitet. Analysen vil tage højde for kendte faktorer af aggressivitet, herunder fedme, MetS-komponenter, etnisk-geografisk oprindelse og positiv familiehistorie af sygdommen.

Metode og teknikker implementeret I- Opbygning af databasen og samling af bioressourcer Hver patient med prostatacancer behandlet ved radikal prostatektomi i netværkets 7 kliniske centre vil blive inkluderet i kohorten. I betragtning af disse centres kirurgiske aktivitet i løbet af de sidste 3 år forventes et minimum af 1000 inklusioner efter 18 måneder med omkring 250 afrikansk-carribiske patienter. Standardiserede kliniske, biologiske og patologiske data vil blive indtastet i en fælles centraliseret eCRF tilgængelig i hvert center (Clinsight®) med central styring og validering (Team 13). Der vil blive ydet økonomisk støtte til de kliniske teams til indtastning af data (teknikere med speciale i klinisk forskning).

De data, der almindeligvis er forbundet med PCa, vil blive indtastet i databasen: administrative elementer (navn, DOB, adresse, hospitalsnr., patologinr), præoperativ PSA, klinisk stadium, patologiske elementer (vægt og størrelse af prøven, patologisk stadium inkl. lymfeknudestatus, Gleason-score, % af grad 4 eller 5, større akse for hovedfokus, marginstatus) og opfølgningspunkter (både biologiske og kliniske). Følgende punkter vil også blive specificeret: BMI, taljeomkreds, fastende glukose, blodtryk, cirkulerende lipider (triglycerider, total-, LDL- og HDL-kolesterol), igangværende behandlinger (lipidsænkende medicin, HTA, behandlinger for diabetes), etnisk-geografisk oprindelse og familiehistorie af PCa Under de kirurgiske indgreb, 3 stk. af bækkenfedtvæv (omkring 5 g, 2 g og 2 g, til henholdsvis opgave 1, 2 og 3 i akse 1) vil blive udtaget, sendt til det biologiske ressourcecenter og straks frosset ved -80°C. Forskerne vælger at prøve visceral WAT i stedet for subkutan WAT, fordi viscerale adipocytter er mere metabolisk aktive (8). Blandt visceral WAT vælger efterforskerne at tage prøver af perivesikalt fedtvæv, da fedt omkring blæren altid er meget rigeligt og nemt kan tages under den kirurgiske procedure. Prostataprøverne sendes straks til patologiske afdelinger og håndteres på en standardiseret måde.

Patienterne, der indgår i kohorten, vil blive bedt om at underskrive et informeret samtykke (efter aftale med Den Etiske Komité/IRB). De kommenterede bioressourcer vedrørende de emner, der indgår i programmerne, vil blive forvaltet i overensstemmelse med reglerne defineret af CNIL.

Udvælgelse af patienter med enten aggressiv eller lavrisikosygdom fra kohorten blandt de 1000 patienter, der forventes ved M18, vil 100 patienter med meget aggressiv sygdom blive udvalgt. Udvælgelsen vil blive foretaget ud fra kriterierne for højrisikosygdom, hovedsageligt højgradig PCa (Gleason score 8 eller mere) og/eller patologisk stadium pT3. Hver af disse 100 patienter vil derefter blive matchet (center for center) med 1 patient med indolent sygdom og identisk status for alder (50 eller derunder, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70, 71-75, mere end 75 år) og BMI (normal, overvægtig og fede). Kriterier for indolent sygdom vil omfatte præoperativ PSA < 10ng/ml og Gleason-score 6 eller mindre (på den kirurgiske prøve) og pT2-stadiet. Hvis flere indolente tilfælde kunne matches med 1 aggressivt tilfælde, vil den med den mindre tumorstørrelse blive foretrukket. Fedtvæv fra disse 200 patienter vil blive brugt.

Målet er at identificere sammenhænge mellem aggressiv og signifikant PCa og sammensætningen af ​​fedtvæv. Forskerne antager, at persistente organiske forurenende stoffer (som afspejler kumulativ tidligere eksponering) og/eller lipidsammensætning (der afspejler tidligere indtag), sammen med adipokinekspression kan være forbundet med sygdoms aggressivitet. Kendte faktorer for PCa-aggressivitet (etnisk oprindelse, familiær historie og fedmestatus) vil blive taget i betragtning.

Opgave 1: Lipidomanalyse Analyser udført på fedtvævsprøverne vil være: i) triglyceridfedtsyresammensætning og ii) fedtcellernes membranfosfolipider klasser relative mængder. Fem store phospholipidklasser fundet i fedtcellers plasmamembran kan adskilles og kvantificeres: phosphatidylcholin, phosphatidylethanolamin, phosphatidylinositol, phosphatidylserin og sphingomyelin. Fedtvæv, der for det meste består af triacylglycerol og kun ca. 1 % phospholipider, vil undersøgelsen af ​​membranphospholipider kræve større prøvemængder (5 g), end det typisk ville være nødvendigt for triglyceriders fedtsyresammensætningsanalyse (400-500 mg).

Fedtvævsprøver vil gennemgå lipidekstraktion ved brug af chloroform og methanol (ifølge Folch-metoden). Kort fortalt vil det samlede ekstrakt blive vakuumtørret og derefter resolubiliseret i en blanding af hexan og methanol for at opdele neutrale (hexanopløselige) og polære (methanolopløselige) lipider. Triglycerider i hexanfasen vil blive yderligere oprenset fra andre neutrale eller polære lipider ved tyndtlagskromatografi på silicagelplader. Oprensede triglycerider vil gennemgå methanol-transesterificering for at producere flygtige fedtsyrer som methylestere. Separation og kvantificering af fedtsyrer vil blive udført ved gaskromatografi (BPX-70 fase kapillarsøjle, on-column injektion, flammeioniseringsdetektor).

Opgave 2: Adipokinmålinger Totalt RNA fra fedtvævsprøver vil blive ekstraheret ved Trizol-teknikken, og RNA-kvaliteten vil blive kontrolleret ved gel agaroseelektroforese og kvantificering ved NanoDrop. Efter revers transkription af kodende mRNA til cDNA, vil kontrolkvaliteten af ​​revers transkription PCR-amplifikation blive udført under anvendelse af et husholdningsgen i det lave antal cyklusser og ny kontrol med gel agarose. Real-time kvantitativ PCR vil derefter blive udført i tre eksemplarer på ni gener af interesse (adipokiner) og tre husholdningsgener til normalisering (18S, beta-actin og SDHA), dvs. 10 800 point genereret. PCR'er vil blive lavet i plader med 384 brønde, og reaktionsblandingerne distribueres ved robotdistribution. Adipokinliste (n=9): chemerin, interleukin-6 (IL-6), plasminogenaktivator-hæmmer-1 (PAI-1), retinolbinding protein 4 (RBP4), tumornekrosefaktor-alfa (TNF-alfa), visfatin, leptin, adiponectin, apelin.

Opgave 3: Målinger af persistente organiske forurenende stoffer (organiske chlorpesticider) Den analytiske metodologi, der anvendes til at måle de målrettede organochorine pesticider, er afledt af procedurer, der tidligere er udviklet, valideret og akkrediteret for andre klasser af lipofile persistente organiske forurenende stoffer såsom dioxiner og PCB-forbindelser. Kort fortalt vil et indledende trin under anvendelse af accelereret opløsningsmiddelekstraktion (ASE) blive efterfulgt af successive oprensningstrin på aktiverede silica- og celite-søjler. Målingen vil blive udført ved hjælp af gaskromatografi koblet til høj opløsning og/eller tandem massespektrometri (GC-HRMS, GC-MS/MS). Kvantificeringen vil blive opnået i henhold til isotopfortyndingsmetoden (dvs. ved at bruge 13C mærket analogt som interne standarder). Udvælgelsen af ​​de vigtigste målrettede stoffer vil være foreløbig baseret på Stockholm-konventionen, der opregner omkring 12 store pesticider, der giver anledning til bekymring.

Den multicenter standardiserede kliniske og biologiske database vil identificere 2 homogene grupper af PCa-patienter med karakteristika for enten aggressiv eller potentielt indolent sygdom. Forskerne forventer, at analysen af ​​bækkenfedtvæv vil vise, om nogle kategorier af 1/ Lipider (afspejler kosten), 2/ Adipokiner og 3/ Stored Xenobiotika fortrinsvis er forbundet med en større eller lavere risiko for PCa-aggressivitet. En sådan identifikation kan derefter føre til forebyggende strategier.