Red Estructural sobre el Cáncer de Próstata en la Región del Gran Oeste Francés (RESCAP)

Relevancia y enfoque estratégico El cáncer de próstata (CaP) es el cáncer más común en los hombres y la segunda causa de muerte por cáncer en los países occidentales. Los factores de riesgo conocidos son la edad avanzada, los orígenes étnicos y los antecedentes familiares positivos de la enfermedad (1). Existen disparidades étnicas considerables en el riesgo de CaP, con una tasa de incidencia un 60 % mayor entre los hombres afroamericanos (AA) en comparación con los hombres europeo-americanos (EA) (2). Del mismo modo, en las Antillas francesas, donde al menos el 90% de los habitantes son afrodescendientes, la incidencia de CaP es el doble que en el resto de Francia (3). Muchos estilos de vida, factores de riesgo relacionados con el medio ambiente y el trabajo, como la obesidad, la dieta, los medicamentos y los pesticidas, se han implicado en la etiología del CaP, pero sus funciones siguen sin estar claras (4). La investigación actual sugiere que existe una interacción compleja de factores genéticos y ambientales que tienen un papel causal en el CaP.

El CaP también tiene un potencial de evolución muy heterogéneo. Mientras que algunos cánceres se comportarán de manera agresiva, otros pacientes tendrán una forma indolente de la enfermedad que no requerirá ningún tratamiento. Se utilizan varios parámetros para predecir el riesgo de evolución en pacientes con CaP, ya sea antes de cualquier tratamiento: estadio clínico, puntaje de Gleason en biopsias y antígeno prostático específico (PSA) sérico, o después del análisis de muestras de prostatectomía radical: estadio patológico y Gleason quirúrgico. puntuación (5). Sin embargo, a pesar del valor de estos factores pronósticos, el potencial de agresividad sigue siendo difícil de evaluar en el momento del diagnóstico, y los pacientes clasificados dentro del grupo de riesgo intermedio a menudo son difíciles de manejar. Es un desafío descubrir nuevos marcadores y nuevos objetivos para la manipulación terapéutica temprana.

Tanto los factores genéticos como los ambientales se han relacionado con el riesgo de enfermedad agresiva. Es probable que el origen étnico desempeñe un papel, ya que se informa que la proporción de casos diagnosticados en la etapa metastásica es mayor en pacientes afroamericanos (35 %) que en pacientes europeo-americanos (22 %), con una tasa de 2,4 veces mayor. mayor tasa de mortalidad en hombres AA que en hombres EA (2). Junto con los factores genéticos, los factores ambientales también parecen desempeñar un papel clave en la progresión del CaP. Algunos factores ambientales, como la obesidad, se han asociado con CaP agresivo (6). Sin embargo, queda mucho por investigar sobre el papel de los factores genéticos y ambientales y su interacción en la agresividad del CaP. El tejido adiposo blanco (WAT) y los lípidos están potencialmente involucrados en el desarrollo y/o progresión del CaP en muchos niveles.

WAT es un órgano endocrino metabólicamente activo. Los adipocitos secretan una variedad de hormonas, péptidos bioactivos y citocinas, denominadas adipocinas (9). Varias adipoquinas han estado involucradas en los mecanismos que llevan a la progresión y agresividad del CaP, incluyendo la leptina, la interleuquina IL-6 y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

Almacenamiento de disruptores endocrinos. Se cree que los disruptores endocrinos (DE) están involucrados en el cáncer de próstata (10). Sin embargo, la evidencia epidemiológica de un vínculo positivo entre las exposiciones ambientales a la DE es limitada. Dos estudios que utilizaron plasma sanguíneo o grasa abdominal para monitorear contaminantes persistentes han mostrado asociaciones positivas con el riesgo de CaP (transclordano, beta-hexaclorociclohexano, trans-nonacloro, dieldrina y bifenilo policlorado 153) (11, 12). Un estudio reciente realizado en las Antillas francesas mostró que la clordecona, un pesticida organoclorado con propiedades estrogénicas bien definidas, aumenta el riesgo de CaP y se asocia con una forma agresiva de la enfermedad en sujetos con antecedentes familiares positivos de CaP (13). .

Composición WAT: Lipidoma. Entre los nutrientes, los lípidos de la dieta son los principales determinantes de la composición general de lípidos del WAT, según lo evaluado durante los estudios de intervención dietética (19-22). Entre los ácidos grasos, los ácidos grasos poliinsaturados esenciales (PUFA) son una subclase de componentes bioactivos divididos en dos grupos, ácidos grasos n-6 y n-3. La serie n-6 incluye el precursor ácido linoleico (LA, 18:2n-6). La serie n-3 incluye el precursor ácido alfa-linolénico (ALA, 18:3n-3) y derivados altamente insaturados. Se ha demostrado que la composición de ácidos grasos del WAT refleja la ingesta anterior de ácidos grasos (23). Aunque no hay estudios concluyentes que muestren una asociación entre la ingesta total de grasas en la dieta y el riesgo de CaP, los tipos específicos de grasas en la dieta (grasa animal) parecen ser más importantes para aumentar el riesgo de CaP (6, 28). La asociación entre el consumo de pescado (rico en PUFA omega-3 de cadena larga) y un menor riesgo de cáncer de próstata es controvertida, pero se ha descrito una reducción significativa en la mortalidad específica por cáncer de próstata (29). Estudios previos que analizaron la composición de PUFA en los tejidos de la próstata han dado lugar a resultados contradictorios. Sin embargo, nunca se ha estudiado la composición de ácidos grasos del WAT en el CaP en relación con la agresividad y la progresión.

El objetivo del programa es estructurar una red que asocie a médicos, patólogos y científicos dedicados al manejo e investigación del cáncer de próstata. La red generará una base de datos centralizada multicéntrica de pacientes con CaP tratados mediante prostatectomía radical, con una colección de biorrecursos estandarizados, incluidas muestras de próstata y tejido adiposo. El uso de los biorrecursos estará orientado principalmente a las relaciones entre tejido adiposo/lípidos y agresividad del CaP.

El proyecto tiene como objetivo caracterizar una asociación entre la agresividad del CaP y la composición del tejido adiposo pélvico. Se analizarán muestras de tejido adiposo de pacientes con CaP de bajo riesgo (n=100) o agresivo (n=100) para 1/ el perfil lipídico (composición de ácidos grasos y proporciones de fosfolípidos), 2/ expresión de adipocinas y 3/ persistencia contaminantes orgánicos con actividad similar a la de las hormonas. El análisis tendrá en cuenta los factores conocidos de agresividad, incluida la obesidad, los componentes de MetS, el origen etnogeográfico y los antecedentes familiares positivos de la enfermedad.

Metodología y técnicas implementadas I- Constitución de la base de datos y colección de biorrecursos Cada paciente con cáncer de próstata tratado mediante prostatectomía radical en los 7 centros clínicos de la red será incluido en la cohorte. Dada la actividad quirúrgica de estos centros durante los últimos 3 años, se espera un mínimo de 1000 inclusiones después de 18 meses, con alrededor de 250 pacientes afro-caribeños. Los datos clínicos, biológicos y patológicos estandarizados se ingresarán en un eCRF centralizado común disponible en cada centro (Clinsight®) con gestión y validación central (Team 13). Se brindará apoyo económico a los equipos clínicos para el ingreso de datos (técnicos especialistas en investigación clínica).

Se ingresarán en la base de datos los datos comúnmente asociados al CaP: ítems administrativos (nombre, fecha de nacimiento, dirección, N° de Hospital, N° de Patología), PSA preoperatorio, estadio clínico, ítems patológicos (peso y tamaño de la muestra, estadio patológico incluyendo estado ganglionar, puntaje de Gleason, % de grado 4 o 5, eje mayor del foco principal, estado de los márgenes) y ítems de seguimiento (tanto biológico como clínico). También se especificarán los siguientes ítems: IMC, perímetro de cintura, glucosa en ayunas, presión arterial, lípidos circulantes (triglicéridos, colesterol total, LDL y HDL), tratamientos en curso (hipolipemiantes, HTA, tratamientos para la diabetes), origen etnogeográfico y antecedentes familiares de CaP Durante los procedimientos quirúrgicos, 3 piezas de tejido adiposo pélvico (alrededor de 5g, 2g y 2g, para las tareas 1, 2 y 3 del Eje 1, respectivamente) serán muestreados, enviados al centro de recursos biológicos e inmediatamente congelados a -80°C. Los investigadores eligen tomar muestras de WAT visceral en lugar de WAT subcutáneo, porque los adipocitos viscerales son metabólicamente más activos (8). Entre los WAT viscerales, los investigadores optan por tomar muestras de tejido adiposo perivesical, ya que la grasa alrededor de la vejiga siempre es muy abundante y puede extraerse fácilmente durante el procedimiento quirúrgico. Las muestras de próstata se enviarán de inmediato a los departamentos de patología y se manejarán de manera estandarizada.

A los pacientes incluidos en la cohorte se les pedirá que firmen un consentimiento informado (previo acuerdo del Comité Ético/IRB). Los biorrecursos anotados relativos a las materias incluidas en los programas serán gestionados respetando las normas definidas por la CNIL.

Selección de pacientes con enfermedad agresiva o de bajo riesgo de la cohorte de los 1000 pacientes esperados en M18, se seleccionarán 100 pacientes con enfermedad altamente agresiva. La selección se realizará en base a los criterios de enfermedad de alto riesgo, principalmente CaP de alto grado (puntuación de Gleason igual o superior a 8) y/o estadio patológico pT3. Cada uno de estos 100 pacientes se emparejará (centro por centro) con 1 paciente con enfermedad indolente y estado idéntico para la edad (50 o menos, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70, 71-75, mayores de 75 años) e IMC (normal, sobrepeso y obesidad). Los criterios para la enfermedad indolente incluirán PSA preoperatorio < 10 ng/ml y puntuación de Gleason de 6 o menos (en la pieza quirúrgica) y estadio pT2. Si se pueden emparejar varios casos indolentes con 1 caso agresivo, se preferirá el que tenga el tamaño del tumor más pequeño. Se utilizará tejido adiposo muestreado de estos 200 pacientes.

El objetivo es identificar asociaciones entre CaP agresivo y significativo y la composición del tejido adiposo. Los investigadores plantean la hipótesis de que los contaminantes orgánicos persistentes (que reflejan la exposición pasada acumulada) y/o la composición de lípidos (que reflejan la ingesta pasada), podrían estar, junto con la expresión de adipocinas, asociados con la agresividad de la enfermedad. Se tendrán en cuenta los factores conocidos de agresividad del CaP (origen étnico, antecedentes familiares y estado de obesidad).

Tarea 1: Análisis de lipidoma Los análisis realizados en las muestras de tejido adiposo serán: i) composición de ácidos grasos de triglicéridos, y ii) cantidades relativas de clases de fosfolípidos de membrana de células adiposas. Se pueden separar y cuantificar cinco clases principales de fosfolípidos que se encuentran en la membrana plasmática de las células adiposas: fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina y esfingomielina. El tejido adiposo está compuesto principalmente por triacilglicerol y solo aproximadamente un 1 % de fosfolípidos, por lo que el estudio de los fosfolípidos de membrana requerirá cantidades de muestra mayores (5 g) de lo que normalmente sería necesario para el análisis de la composición de ácidos grasos de triglicéridos (400-500 mg).

Las muestras de tejido adiposo se someterán a extracción de lípidos con el uso de cloroformo y metanol (según el método de Folch). Brevemente, el extracto total se secará al vacío y luego se volverá a solubilizar en una mezcla de hexano y metanol para dividir los lípidos neutros (solubles en hexano) y polares (solubles en metanol). Los triglicéridos en la fase de hexano se purificarán aún más de otros lípidos neutros o polares mediante cromatografía en capa fina en placas de gel de sílice. Los triglicéridos purificados se someterán a transesterificación de metanol para producir ácidos grasos volátiles como ésteres metílicos. La separación y cuantificación de ácidos grasos se realizará mediante cromatografía de gases (columna capilar de fase BPX-70, inyección en columna, detector de ionización de llama).

Tarea 2: Mediciones de adipocinas Se extraerá el ARN total de muestras de tejido adiposo mediante la técnica Trizol y se comprobará la calidad del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa y cuantificación mediante NanoDrop. Después de la transcripción inversa del ARNm codificante en ADNc, la calidad de control de la amplificación por PCR de transcripción inversa se realizará utilizando un gen de mantenimiento en el bajo número de ciclos y un nuevo control mediante gel de agarosa. A continuación, se realizará una PCR cuantitativa en tiempo real por triplicado en nueve genes de interés (adipoquinas) y tres genes de mantenimiento para la normalización (18S, beta-actina y SDHA), es decir, se generarán 10 800 puntos. Las PCR se realizarán en placas de 384 pocillos y las mezclas de reacción se distribuirán mediante distribución robotizada. Lista de adipoquinas (n=9): quimerina, interleuquina-6 (IL-6), inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1), unión a retinol proteína 4 (RBP4), factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa), visfatina, leptina, adiponectina, apelina.

Tarea 3: Mediciones de contaminantes orgánicos persistentes (pesticidas organoclorados) La metodología analítica utilizada para medir los plaguicidas organoclorados específicos se deriva de procedimientos previamente desarrollados, validados y acreditados para otras clases de contaminantes orgánicos persistentes lipofílicos como las dioxinas y los compuestos de PCB. Brevemente, a un paso preliminar con extracción acelerada por solventes (ASE) le seguirán sucesivas etapas de purificación en columnas de sílice activada y celite. La medida se realizará mediante cromatografía de gases acoplada a alta resolución y/o espectrometría de masas en tándem (GC-HRMS, GC-MS/MS). La cuantificación se logrará de acuerdo con el método de dilución isotópica (es decir, utilizando análogos marcados con 13C como estándares internos). La selección de las principales sustancias objetivo será preliminar y se basará en la convención de Estocolmo que enumera alrededor de 12 pesticidas principales de interés.

La base de datos clínica y biológica estandarizada multicéntrica identificará 2 grupos homogéneos de pacientes con CaP con características de enfermedad agresiva o potencialmente indolente. Los investigadores esperan que el análisis del tejido adiposo pélvico demuestre si algunas categorías de 1/ Lípidos (que reflejan la dieta), 2/ Adipocinas y 3/ Xenobióticos almacenados se asocian preferentemente con un mayor o menor riesgo de agresividad del CaP. Tal identificación podría entonces conducir a estrategias preventivas.