Strukturelles Netzwerk zum Thema Prostatakrebs in der französischen Region Greater West (RESCAP)

Relevanz und strategischer Ansatz Prostatakrebs (PCa) ist die häufigste Krebsart bei Männern und die zweithäufigste Krebstodesursache in den westlichen Ländern. Bekannte Risikofaktoren sind fortgeschrittenes Alter, ethnische Herkunft und eine positive Familienanamnese (1). Es gibt erhebliche ethnische Unterschiede beim PCa-Risiko, mit einer um 60 % höheren Inzidenzrate bei afroamerikanischen (AA) Männern im Vergleich zu europäisch-amerikanischen (EA) Männern (2). Auch in Französisch-Westindien, wo mindestens 90 % der Einwohner afrikanischer Abstammung sind, ist die PCa-Inzidenz doppelt so hoch wie im übrigen Frankreich (3). Viele Lebensstile, umwelt- und berufsbezogene Risikofaktoren, einschließlich Fettleibigkeit, Ernährung, Medikamente und Pestizide, wurden in die Ätiologie von PCa verwickelt, aber ihre Rolle bleibt unklar (4). Aktuelle Forschungsergebnisse legen nahe, dass es ein komplexes Zusammenspiel genetischer und umweltbedingter Faktoren gibt, die eine ursächliche Rolle bei PCa spielen.

PCa hat auch ein sehr heterogenes Evolutionspotential. Während sich einige Krebsarten aggressiv verhalten, haben andere Patienten eine träge Form der Krankheit, die möglicherweise keiner Behandlung bedarf. Mehrere Parameter werden verwendet, um das Entwicklungsrisiko bei PCa-Patienten vorherzusagen, entweder vor jeder Behandlung: klinisches Stadium, Gleason-Score bei Biopsien und prostataspezifisches Antigen (PSA) im Serum oder nach der Analyse von radikalen Prostatektomieproben: pathologisches Stadium und chirurgischer Gleason Punktzahl (5). Trotz des Werts dieser prognostischen Faktoren bleibt das Potenzial der Aggressivität jedoch bei der Diagnose schwer einzuschätzen, und Patienten, die in die mittlere Risikogruppe eingestuft werden, sind oft schwierig zu handhaben. Es ist eine Herausforderung, neue Marker und neue Ziele für eine frühe therapeutische Manipulation zu entdecken.

Sowohl genetische als auch Umweltfaktoren wurden mit dem Risiko aggressiver Krankheiten in Verbindung gebracht. Die ethnische Herkunft dürfte eine Rolle spielen, da der Anteil der im Metastasenstadium diagnostizierten Fälle bei afroamerikanischen Patienten (35 %) mit 2,4-fach höher als bei europäisch-amerikanischen Patienten (22 %) angegeben wird höhere Sterblichkeitsrate bei AA-Männern als bei EA-Männern (2). Zusammen mit genetischen Faktoren scheinen auch Umweltfaktoren eine Schlüsselrolle bei der PCa-Progression zu spielen. Einige Umweltfaktoren wie Fettleibigkeit wurden mit aggressivem PCa in Verbindung gebracht (6). Es bleibt jedoch noch viel zu erforschen über die Rolle genetischer und umweltbedingter Faktoren und ihr Zusammenspiel bei der PCa-Aggressivität. Weißes Fettgewebe (WAT) und Lipide sind möglicherweise auf vielen Ebenen an der Entwicklung und/oder Progression von PCa beteiligt.

WAT ist ein stoffwechselaktives endokrines Organ. Adipozyten scheiden eine Vielzahl von Hormonen, bioaktiven Peptiden und Zytokinen aus, die als Adipokine bezeichnet werden (9). Mehrere Adipokine waren an den Mechanismen beteiligt, die zu PCa-Progression und Aggressivität führen, darunter Leptin, Interleukin IL-6 und vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF).

Lagerung endokriner Disruptoren. Es wird angenommen, dass endokrine Disruptoren (ED) an Prostatakrebs beteiligt sind (10). Epidemiologische Beweise für einen positiven Zusammenhang zwischen Umweltexpositionen gegenüber ED sind jedoch begrenzt. Zwei Studien mit Blutplasma oder Bauchfett zur Überwachung persistenter Schadstoffe haben positive Assoziationen mit dem PCa-Risiko gezeigt (Transchlordan, beta-Hexachlorcyclohexan, trans-Nonachlor, Dieldrin und polychloriertes Biphenyl 153) (11, 12). Eine kürzlich in Französisch-Westindien durchgeführte Studie zeigte, dass Chlordecon, ein Organochlor-Pestizid mit gut definierten östrogenen Eigenschaften, das PCa-Risiko erhöht und mit einer aggressiven Form der Krankheit bei Personen mit einer positiven PCa-Familienanamnese in Verbindung gebracht wird (13). .

WAT-Zusammensetzung: Lipidom. Unter den Nährstoffen sind Nahrungslipide Hauptdeterminanten der gesamten Lipidzusammensetzung von WAT, wie sie während diätetischer Interventionsstudien bewertet wurden (19-22). Unter den Fettsäuren sind essentielle mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAs) eine Unterklasse bioaktiver Komponenten, die in zwei Gruppen unterteilt sind, n-6- und n-3-Fettsäuren. Die n-6-Reihe umfasst die Vorstufe Linolsäure (LA, 18:2n-6). Die n-3-Reihe umfasst die Vorstufe Alpha-Linolensäure (ALA, 18:3n-3) und hochungesättigte Derivate. Es wurde gezeigt, dass die Fettsäurezusammensetzung von WAT die frühere Fettsäureaufnahme widerspiegelt (23). Obwohl es keine schlüssigen Studien gibt, die einen Zusammenhang zwischen der gesamten Nahrungsfettaufnahme und dem PCa-Risiko zeigen, scheinen bestimmte Arten von Nahrungsfett (tierisches Fett) bei der Erhöhung des PCa-Risikos signifikanter zu sein (6, 28). Der Zusammenhang zwischen Fischkonsum (reich an langkettigen Omega-3-PUFAs) und einem geringeren Prostatakrebsrisiko ist umstritten, es wurde jedoch eine signifikante Verringerung der prostatakrebsspezifischen Mortalität beschrieben (29). Frühere Studien zur Analyse der PUFA-Zusammensetzung in Prostatageweben haben zu widersprüchlichen Ergebnissen geführt. Die Fettsäurezusammensetzung von WAT wurde jedoch noch nie bei PCa in Verbindung mit Aggressivität und Progression untersucht.

Ziel des Programms ist die Strukturierung eines Netzwerks aus Klinikern, Pathologen und Wissenschaftlern, die sich mit Prostatakrebsmanagement und -forschung befassen. Das Netzwerk wird eine multizentrische zentrale Datenbank von PCa-Patienten erstellen, die durch radikale Prostatektomie behandelt wurden, mit einer standardisierten Sammlung von Bioressourcen, einschließlich Prostata- und Fettgewebeproben. Die Nutzung der Bioressourcen wird sich hauptsächlich an den Zusammenhängen zwischen Fettgewebe/Lipiden und PCa-Aggressivität orientieren.

Das Projekt zielt darauf ab, einen Zusammenhang zwischen PCa-Aggressivität und der Zusammensetzung des Beckenfettgewebes zu charakterisieren. Fettgewebeproben von Patienten mit entweder niedrigem Risiko (n=100) oder aggressivem (n=100) PCa werden auf 1/ das Lipidprofil (Fettsäurezusammensetzung und Phospholipidanteile), 2/ Expression von Adipokinen und 3/ persistent analysiert organische Schadstoffe mit hormonähnlicher Wirkung. Die Analyse berücksichtigt bekannte Faktoren der Aggressivität, einschließlich Fettleibigkeit, MetS-Komponenten, ethno-geografischer Herkunft und positiver Familienanamnese der Krankheit.

Methodik und implementierte Techniken I- Erstellung der Datenbank und Sammlung von Bioressourcen Jeder Patient mit Prostatakrebs, der in den 7 klinischen Zentren des Netzwerks durch radikale Prostatektomie behandelt wurde, wird in die Kohorte aufgenommen. Angesichts der chirurgischen Aktivität dieser Zentren in den letzten 3 Jahren wird nach 18 Monaten mit etwa 250 afrikanisch-karibischen Patienten mindestens 1000 Einschlüsse erwartet. Standardisierte klinische, biologische und pathologische Daten werden in ein gemeinsames zentralisiertes eCRF eingegeben, das in verfügbar ist jedes Zentrum (Clinsight®) mit zentraler Verwaltung und Validierung (Team 13). Die klinischen Teams werden für die Eingabe der Daten finanziell unterstützt (auf klinische Forschung spezialisierte Techniker).

Die üblicherweise mit PCa verbundenen Daten werden in die Datenbank eingegeben: Verwaltungsdaten (Name, Geburtsdatum, Adresse, Krankenhaus-Nr., Pathologie-Nr.), präoperativer PSA, klinisches Stadium, pathologische Daten (Gewicht und Größe der Probe, pathologisches Stadium einschließlich Lymphknotenstatus, Gleason-Score, % Grad 4 oder 5, größere Achse des Hauptfokus, Randstatus) und Follow-up-Elemente (sowohl biologisch als auch klinisch). Die folgenden Elemente werden ebenfalls angegeben: BMI, Taillenumfang, Nüchternglukose, Blutdruck, zirkulierende Lipide (Triglyceride, Gesamt-, LDL- und HDL-Cholesterin), laufende Behandlungen (lipidsenkende Medikamente, HTA, Behandlungen für Diabetes), ethnogeografische Herkunft und Familiengeschichte von PCa Während der chirurgischen Eingriffe, 3 Stück Beckenfettgewebe (ca. 5 g, 2 g bzw. 2 g für die Aufgaben 1, 2 und 3 von Achse 1) werden entnommen, an das Zentrum für biologische Ressourcen geschickt und sofort bei -80 °C eingefroren. Die Forscher entscheiden sich dafür, viszerales WAT anstelle von subkutanem WAT zu entnehmen, da viszerale Adipozyten metabolisch aktiver sind (8). Bei der viszeralen WAT entscheiden sich die Ermittler dafür, perivesikales Fettgewebe zu entnehmen, da Fett um die Blase herum immer sehr reichlich vorhanden ist und während des chirurgischen Eingriffs leicht entnommen werden kann. Die Prostataproben werden umgehend an die Pathologieabteilungen geschickt und standardisiert verwaltet.

Die in die Kohorte aufgenommenen Patienten werden gebeten, eine Einverständniserklärung zu unterzeichnen (nach Zustimmung der Ethikkommission/IRB). Die kommentierten Bio-Ressourcen zu den in den Programmen enthaltenen Themen werden gemäß den von der CNIL festgelegten Regeln verwaltet.

Auswahl von Patienten mit entweder aggressiver oder Niedrigrisikoerkrankung aus der Kohorte von den 1000 Patienten, die bei M18 erwartet werden, 100 Patienten mit hochaggressiver Erkrankung werden ausgewählt. Die Auswahl erfolgt auf der Grundlage der Kriterien einer Hochrisikoerkrankung, hauptsächlich hochgradiges PCa (Gleason-Score 8 oder mehr) und/oder pathologisches Stadium pT3. Jeder dieser 100 Patienten wird dann (Zentrum für Zentrum) mit 1 Patienten mit indolenter Erkrankung und identischem Altersstatus (50 oder weniger, 51–55, 56–60, 61–65, 66–70, 71–75, älter als 75 Jahre) und BMI (normal, übergewichtig und fettleibig). Zu den Kriterien für eine indolente Erkrankung gehören ein präoperativer PSA < 10 ng/ml und ein Gleason-Score von 6 oder weniger (auf dem chirurgischen Präparat) und das pT2-Stadium. Wenn mehrere indolente Fälle einem aggressiven Fall zugeordnet werden können, wird derjenige mit der kleineren Tumorgröße bevorzugt. Von diesen 200 Patienten entnommenes Fettgewebe wird verwendet.

Ziel ist es, Zusammenhänge zwischen aggressivem und signifikantem PCa und der Zusammensetzung des Fettgewebes zu identifizieren. Die Forscher vermuten, dass persistente organische Schadstoffe (die die kumulative frühere Exposition widerspiegeln) und/oder die Lipidzusammensetzung (die die frühere Aufnahme widerspiegeln) zusammen mit der Adipokin-Expression mit der Aggressivität der Krankheit in Verbindung gebracht werden könnten. Bekannte Faktoren der PCa-Aggressivität (ethnische Herkunft, Familiengeschichte und Adipositasstatus) werden berücksichtigt.

Aufgabe 1: Lipidomanalyse An den Fettgewebeproben durchgeführte Analysen sind: i) Triglyceridfettsäurezusammensetzung und ii) relative Mengen der Phospholipidklassen der Fettzellenmembran. Fünf Hauptklassen von Phospholipiden, die in der Plasmamembran von Fettzellen gefunden werden, können getrennt und quantifiziert werden: Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin und Sphingomyelin. Da Fettgewebe hauptsächlich aus Triacylglycerol und nur ungefähr 1 % Phospholipiden besteht, erfordert die Untersuchung von Membranphospholipiden größere Probenmengen (5 g), als typischerweise für die Analyse der Triglycerid-Fettsäure-Zusammensetzung (400-500 mg) erforderlich wären.

Fettgewebeproben werden einer Lipidextraktion unter Verwendung von Chloroform und Methanol (nach der Folch-Methode) unterzogen. Kurz gesagt wird der Gesamtextrakt vakuumgetrocknet und dann in einer Mischung aus Hexan und Methanol wieder gelöst, um neutrale (in Hexan lösliche) und polare (in Methanol lösliche) Lipide zu trennen. Triglyceride in der Hexanphase werden weiter von anderen neutralen oder polaren Lipiden durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgelplatten gereinigt. Gereinigte Triglyceride werden einer Methanolumesterung unterzogen, um flüchtige Fettsäuren als Methylester herzustellen. Die Trennung und Quantifizierung von Fettsäuren erfolgt mittels Gaschromatographie (BPX-70-Phasenkapillarsäule, On-Column-Injektion, Flammenionisationsdetektor).

Aufgabe 2: Adipokin-Messungen Gesamt-RNA aus Fettgewebeproben wird mit der Trizol-Technik extrahiert und die RNA-Qualität wird durch Gel-Agarose-Elektrophorese und Quantifizierung durch NanoDrop überprüft. Nach der reversen Transkription der kodierenden mRNA in cDNA wird die Kontrollqualität der reversen Transkriptions-PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Housekeeping-Gens in der geringen Anzahl von Zyklen und einer neuen Kontrolle durch Gel-Agarose durchgeführt. Anschließend wird eine quantitative Echtzeit-PCR dreifach an neun interessierenden Genen (Adipokine) und drei Housekeeping-Genen zur Normalisierung (18S, Beta-Aktin und SDHA) durchgeführt, dh es werden 10.800 Punkte generiert. PCRs werden in 384-Well-Platten durchgeführt und die Reaktionsmischungen durch Roboterverteilung verteilt. Adipokin-Liste (n = 9): Chemerin, Interleukin-6 (IL-6), Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 (PAI-1), Retinolbindung Protein 4 (RBP4), Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-alpha), Visfatin, Leptin, Adiponektin, Apelin.

Aufgabe 3: Messungen persistenter organischer Schadstoffe (organochlorhaltige Pestizide) Die zur Messung der gezielten chlororganischen Pestizide verwendete analytische Methodik leitet sich von Verfahren ab, die zuvor für andere Klassen lipophiler persistenter organischer Schadstoffe wie Dioxine und PCB-Verbindungen entwickelt, validiert und akkreditiert wurden. Kurz gesagt, auf einen vorbereitenden Schritt unter Verwendung einer beschleunigten Lösungsmittelextraktion (ASE) folgen aufeinanderfolgende Reinigungsstufen auf aktivierten Silica- und Celite-Säulen. Die Messung erfolgt mittels Gaschromatographie gekoppelt mit hochauflösender und/oder Tandem-Massenspektrometrie (GC-HRMS, GC-MS/MS). Die Quantifizierung erfolgt nach der Isotopenverdünnungsmethode (d. h. mit analog markiertem 13C als internem Standard). Die Auswahl der wichtigsten Zielsubstanzen erfolgt vorläufig auf der Grundlage der Stockholmer Konvention, in der etwa 12 wichtige Pestizide aufgeführt sind, die Anlass zur Sorge geben.

Die multizentrische standardisierte klinische und biologische Datenbank wird 2 homogene Gruppen von PCa-Patienten mit Merkmalen entweder einer aggressiven oder potenziell indolenten Erkrankung identifizieren. Die Forscher erwarten, dass die Analyse des Beckenfettgewebes zeigen wird, ob einige Kategorien von 1/ Lipiden (die die Ernährung widerspiegeln), 2/ Adipokine und 3/ gelagerte Xenobiotika bevorzugt mit einem größeren oder niedrigeren Risiko für PCa-Aggressivität assoziiert sind. Eine solche Identifizierung könnte dann zu präventiven Strategien führen.