Cirkulující fibrocyty – nový a přesný biomarker v diagnostice akutní apendicitidy u dospělých

Akutní apendicitida (AA) je nejčastější abdominální pohotovost. Navzdory vysoké prevalenci zůstává diagnostika apendicitidy výzvou. Klinický obraz je často atypický a symptomy se často překrývají s mnoha dalšími stavy. Spolu s tím může nedosažení včasné diagnózy vést k nepříznivým výsledkům.

Cirkulující fibrocyty (CF) byly poprvé popsány v roce 1994 Richardem Bucalou. Jsou to hematopoetické buňky pocházející z kostní dřeně. Cirkulují ve frakci monocytů a mohou se diferencovat na myelofibrocyty, fibroblasty a adipocyty (mimo jiné typy buněk). Mají významnou roli v zánětlivých a hojivých procesech a při rozvoji fibrózy.

Dosud žádné studie nezkoumaly roli CF u akutní apendicitidy. Cílem této klinické studie tedy bylo (1) zjistit, zda jsou CF změněny u akutní apendicitidy, (2) posoudit a porovnat jejich diagnostickou přesnost s CRP, WCC, neutrofily, lymfocyty, poměrem neutrofilů a lymfocytů (NLR), monocyty bazofily a eozinofily a (3) určit nejspolehlivější prediktory v diagnostice AA.

Byla provedena prospektivní kohortová studie s cílem (1) stanovit hladiny cirkulujících fibrocytů (CF) u pacientů s histologicky potvrzenou akutní apendicitidou (AA) a (2) stanovit senzitivitu a specificitu hladin cirkulujícího CF při diagnóze AA u dospělých (věk ≥ 16 let) projevující se akutně bolestí pravé jámy kyčelní ve Fakultní nemocnici v Limericku. Diagnóza apendicitidy byla potvrzena histopatologickým vyšetřením po apendicektomii.

Pacienti byli rozděleni do tří kohort po jejich konečné diagnóze při propuštění a na základě histopatologických výsledků. (1) pacienti s RIFP, kteří podstoupili apendicektomii a měli normální apendix při histologickém vyšetření, tj. histologicky prokázaná normální skupina slepého střeva (HPNG). (2) pacienti s RIFP, kteří podstoupili apendicektomii a měli zanícené apendix při histologickém vyšetření, tj. skupina s histologicky prokázanou apendicitidou (HPAG). (3) pacienti s RIFP, kteří měli při propuštění jinou diagnózu než apendicitidu, tj. alternativní diagnostickou skupinu (ADG). Další kohorta byla přidána jako (4) zdravé kontroly.

Shromážděná data zahrnovala datum přijetí, pohlaví pacienta, věk, projevující se symptomy, trvání symptomů, hladiny CF, předoperační WCC a jeho rozdíly (poměr neutrofilů, lymfocytů, neutrofilů a lymfocytů (NLR), počty monocytů, bazofilů a eozinofilů), CRP, konečná klinická diagnóza, operace a pooperační diagnóza založená na histologickém vyšetření.

Vzorky periferních žil byly získány od pacientů v kohortě 1, 2 a 3 (n=80) a zdravých kontrol (n=15). Jeden 10 ml vzorek heparinizované žilní krve byl odebrán periferní venepunkcí horní končetiny. Vzorky byly odebrány do vakuových zkumavek s heparinem sodným (EDTA) a přeneseny do laboratoře do 3 hodin. Vzorky byly poté zpracovány, aby se izolovala vrstva bílých krvinek pomocí centrifugace s hustotním gradientem (Histopaque, Sigma-Aldrich, Wicklow, Irsko). Výsledné mononukleární buňky periferní krve byly následně promyty ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS) a resuspendovány v mrazicím médiu (50 % fetální bovinní sérum, 40 % RPMI médium a 10 % dimethylsulfoxid) před přenesením do kryogenních lahviček v 1- ml alikvoty. Nakonec byly vzorky ochlazeny v nádobě pro řízení rychlosti kryogenní teploty na -80 °C až do zpracování pro průtokovou cytometrii. Po izolaci bílých krvinek pomocí centrifugace s hustotním gradientem bylo 1x106 buněk resuspendováno v pufru pro průtokovou cytometrii (RPMI médium doplněné 10% koňským sérem, 0,1% azidem sodným a 25 mM HEPES). Buňky byly fixovány a permeabilizovány pomocí roztoku BD Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Oxford, Anglie) a blokovány před intracelulárním barvením kolagenu-I myší anti-lidskou protilátkou proti kolagenu-I (Millipore, Cork, Irsko, kód produktu MAB3391), která byl následně obarven Alexa-Fluor 488 kozí anti-myší sekundární protilátkou (Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, Anglie; kód produktu 115-545-146). Buňky byly poté obarveny na buněčný povrchový antigen CD45 s použitím PerCP anti-lidského CD45 (Biolegend, Londýn, Anglie). Buňky byly poté resuspendovány v PBS před následnou analýzou na průtokovém cytometru (BD FACSVerse). Všechny analýzy byly provedeny na BD FACSVerse (BD Biosciences) s použitím BD FACSuite v1.0.5 (BD Biosciences). Hladiny fibrocytů byly zobrazeny jako procento z celkové populace bílých krvinek.

Analýza dat byla provedena pomocí IBM SPSS pro Mac OSX verze 25.0. Data byla prezentována jako průměry a standardní odchylky, případně mediány a mezikvartilní rozmezí. Distribuce proměnných byla hodnocena pomocí histogramů, Q-Q grafů a krabicových grafů. Analýza rozptylu (Jednocestná ANOVA) byla použita k porovnání mezi různými nezávislými skupinami. Kruskal-Wallisův test byl použit ke srovnání mezi biomarkery a různými skupinami (HPNG vs. HPAG vs. ADG) a pro analýzu podskupin byla provedena párová srovnání, hodnota P menší než 0,05 byla považována za statisticky významnou. K charakterizaci a srovnání diagnostické přesnosti CF, WCC, CRP, neutrofilů, NLR a monocytů byla použita křivka operační charakteristiky přijímače (ROC). K posouzení nezávislých prediktorů pro AA byla použita multinomická logistická regresní analýza.