Il fibrocita circolante: un nuovo e accurato biomarcatore nella diagnosi di appendicite acuta negli adulti

L'appendicite acuta (AA) è l'emergenza addominale più comune. Nonostante la sua alta prevalenza, la diagnosi di appendicite rimane una sfida. La presentazione clinica è spesso atipica e i sintomi spesso si sovrappongono a molte altre condizioni. Insieme a questo, il mancato raggiungimento di una diagnosi tempestiva può portare a esiti negativi.

I fibrociti circolanti (CF) sono stati descritti per la prima volta nel 1994 da Richard Bucala. Sono cellule ematopoietiche derivate dal midollo osseo. Circolano nella frazione dei monociti e possono differenziarsi in mielofibrociti, fibroblasti e adipociti (tra gli altri tipi di cellule). Hanno un ruolo di primo piano nei processi infiammatori e cicatrizzanti e nello sviluppo della fibrosi.

Nessuno studio fino ad oggi ha esaminato il ruolo dei CF nell'appendicite acuta. Pertanto, gli obiettivi di questo studio clinico erano (1) determinare se i CF sono alterati nell'appendicite acuta, (2) valutare e confrontare la loro accuratezza diagnostica con CRP, WCC, neutrofili, linfociti, rapporto neutrofili-linfociti (NLR), monociti , basofili ed eosinofili, e (3) per determinare i predittori più affidabili nella diagnosi di AA.

È stato intrapreso uno studio prospettico di coorte per (1) determinare i livelli circolanti di fibrociti (CF) in pazienti con appendicite acuta (AA) istologicamente confermata e (2) determinare la sensibilità e la specificità dei livelli circolanti di CF nella diagnosi di AA, negli adulti (età ≥ 16 anni) che si presenta acutamente con dolore alla fossa iliaca destra, presso l'ospedale universitario di Limerick. La diagnosi di appendicite è stata confermata dalla valutazione istopatologica dopo l'appendicectomia.

I pazienti sono stati divisi in tre coorti in seguito alla loro diagnosi finale alla dimissione e sulla base dei risultati istopatologici. (1) pazienti con RIFP che hanno subito un'appendicectomia e avevano un'appendice normale alla valutazione istologica, cioè gruppo di appendice normale istologicamente provato (HPNG). (2) pazienti con RIFP che hanno subito un'appendicectomia e presentavano un'appendice infiammata alla valutazione istologica, ovvero gruppo di appendicite istologicamente provata (HPAG). (3) pazienti con RIFP che avevano una diagnosi alternativa alla dimissione diversa dall'appendicite, cioè gruppo di diagnosi alternativa (ADG). Un'altra coorte è stata aggiunta come (4) controlli sani.

I dati raccolti includevano la data di ricovero, il sesso del paziente, l'età, i sintomi di presentazione, la durata dei sintomi, i livelli di CF, il WCC preoperatorio e i suoi differenziali (neutrofili, linfociti, rapporto neutrofili-linfociti (NLR), conta di monociti, basofili ed eosinofili), CRP, diagnosi clinica finale, operazione e diagnosi post-operatoria basate su valutazione istologica.

I campioni venosi periferici sono stati ottenuti da pazienti nelle coorti 1, 2 e 3 (n = 80) e controlli sani (n = 15). Un singolo campione da 10 mL di sangue venoso eparinizzato è stato raccolto tramite venipuntura periferica dell'arto superiore. I campioni sono stati raccolti in provette vacutainer con eparina sodica (EDTA) e trasferiti al laboratorio entro 3 ore. I campioni sono stati quindi elaborati per isolare lo strato di buffy coat mediante centrifugazione in gradiente di densità (Histopaque, Sigma-Aldrich, Wicklow, Irlanda). Le risultanti cellule mononucleate del sangue periferico sono state successivamente lavate in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e risospese in mezzo di congelamento (50% siero bovino fetale, 40% terreno RPMI e 10% dimetilsolfossido) prima del trasferimento in fiale criogeniche in 1- aliquote ml. Infine, i campioni sono stati raffreddati in un contenitore criogenico per il controllo della temperatura a -80 °C fino al trattamento per la citometria a flusso. Dopo l'isolamento dei globuli bianchi mediante centrifugazione in gradiente di densità, 1 × 106 cellule sono state risospese nel tampone di citometria a flusso (mezzo RPMI integrato con siero di cavallo al 10%, sodio azide allo 0,1% e HEPES 25 mM). Le cellule sono state fissate e permeabilizzate utilizzando la soluzione BD Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Oxford, Inghilterra) e bloccate prima della colorazione intracellulare del collagene-I con l'anticorpo murino anti-collagene-I umano (Millipore, Cork, Irlanda, codice prodotto MAB3391) che è stato successivamente colorato con l'anticorpo secondario anti-topo di capra Alexa-Fluor 488 (Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, Inghilterra; codice prodotto 115-545-146). Le cellule sono state quindi colorate per l'antigene di superficie cellulare CD45 utilizzando PerCP anti-CD45 umano (Biolegend, Londra, Inghilterra). Le cellule sono state quindi risospese in PBS prima della successiva analisi sul citometro a flusso (BD FACSVerse). Tutte le analisi sono state eseguite su un BD FACSVerse (BD Biosciences) utilizzando BD FACSuite v1.0.5 (BD Biosciences). I livelli di fibrociti sono stati visualizzati come percentuale della popolazione totale di globuli bianchi.

Le analisi dei dati sono state eseguite utilizzando IBM SPSS per Mac OSX versione 25.0. I dati sono stati presentati come medie e deviazioni standard, o mediane e intervalli interquartili, a seconda dei casi. La distribuzione delle variabili è stata valutata mediante istogrammi, grafici Q-Q e box plot. L'analisi della varianza (One-Way ANOVA) è stata utilizzata per confrontare diversi gruppi indipendenti. Il test di Kruskal-Wallis è stato utilizzato per confrontare i biomarcatori e i diversi gruppi (HPNG vs. HPAG vs. ADG) e per l'analisi dei sottogruppi sono stati eseguiti confronti a coppie, un valore P inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. La curva delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) è stata utilizzata per caratterizzare e confrontare l'accuratezza diagnostica di CF, WCC, CRP, neutrofili, NLR e monociti. L'analisi di regressione logistica multinomiale è stata utilizzata per valutare predittori indipendenti per AA.