Krążący fibrocyt — nowy i dokładny biomarker w diagnostyce ostrego zapalenia wyrostka robaczkowego u dorosłych

Ostre zapalenie wyrostka robaczkowego (AA) jest najczęstszym stanem nagłym w jamie brzusznej. Pomimo dużej częstości występowania, rozpoznanie zapalenia wyrostka robaczkowego pozostaje wyzwaniem. Obraz kliniczny jest często nietypowy, a objawy często pokrywają się z wieloma innymi schorzeniami. W połączeniu z tym brak szybkiej diagnozy może spowodować niekorzystne skutki.

Krążące fibrocyty (CF) zostały po raz pierwszy opisane w 1994 roku przez Richarda Bucala. Są to komórki krwiotwórcze pochodzące ze szpiku kostnego. Krążą we frakcji monocytów i mogą różnicować się w mielofibrocyty, fibroblasty i adipocyty (wśród innych typów komórek). Odgrywają znaczącą rolę w procesach zapalnych i gojeniu oraz w rozwoju zwłóknienia.

Do tej pory żadne badania nie dotyczyły roli mukowiscydozy w ostrym zapaleniu wyrostka robaczkowego. Zatem celem tego badania klinicznego było (1) określenie, czy CF są zmienione w ostrym zapaleniu wyrostka robaczkowego, (2) ocena i porównanie ich dokładności diagnostycznej z CRP, WCC, neutrofilami, limfocytami, stosunkiem neutrofili do limfocytów (NLR), monocytami , bazofile i eozynofile oraz (3) określenie najbardziej wiarygodnych predyktorów w diagnozowaniu AA.

Przeprowadzono prospektywne badanie kohortowe w celu (1) określenia poziomów krążących fibrocytów (CF) u pacjentów z histologicznie potwierdzonym ostrym zapaleniem wyrostka robaczkowego (AA) oraz (2) określenia czułości i swoistości poziomów krążących mukowiscydozy w diagnostyce AA u dorosłych (wiek ≥ 16 lat) z ostrym bólem prawego dołu biodrowego w szpitalu uniwersyteckim Limerick. Rozpoznanie zapalenia wyrostka robaczkowego potwierdzono badaniem histopatologicznym po wycięciu wyrostka robaczkowego.

Pacjentów podzielono na trzy kohorty po ich ostatecznym rozpoznaniu przy wypisie i na podstawie wyników histopatologicznych. (1) pacjenci z RIFP, którzy przeszli appendektomię i mieli prawidłowy wyrostek robaczkowy w ocenie histologicznej, tj. potwierdzoną histologicznie grupę prawidłowego wyrostka robaczkowego (HPNG). (2) pacjenci z RIFP, którzy przeszli appendektomię i mieli zapalenie wyrostka robaczkowego w ocenie histologicznej, tj. grupę histologicznie potwierdzonego zapalenia wyrostka robaczkowego (HPAG). (3) pacjenci z RIFP, którzy przy wypisie mieli inne rozpoznanie niż zapalenie wyrostka robaczkowego, tj. grupa z rozpoznaniem alternatywnym (ADG). Kolejną kohortę dodano jako (4) zdrowe kontrole.

Zebrane dane obejmowały datę przyjęcia, płeć pacjenta, wiek, występujące objawy, czas trwania objawów, poziomy mukowiscydozy, przedoperacyjną WCC i jej zróżnicowanie (liczba neutrofili, limfocytów, stosunek neutrofilów do limfocytów (NLR), liczba monocytów, bazofili i eozynofili), CRP, ostateczne rozpoznanie kliniczne, rozpoznanie operacyjne i pooperacyjne na podstawie oceny histologicznej.

Próbki żył obwodowych pobrano od pacjentów z kohorty 1, 2 i 3 (n=80) oraz zdrowych osób kontrolnych (n=15). Pojedynczą 10 ml próbkę heparynizowanej krwi żylnej pobrano przez nakłucie żyły obwodowej kończyny górnej. Próbki pobrano do probówek próżniowych z heparyną sodową (EDTA) i przeniesiono do laboratorium w ciągu 3 godzin. Próbki następnie przetwarzano w celu wyizolowania warstwy kożuszka leukocytarnego przy użyciu wirowania w gradiencie gęstości (Histopaque, Sigma-Aldrich, Wicklow, Irlandia). Otrzymane jednojądrzaste komórki krwi obwodowej następnie przemyto solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i ponownie zawieszono w pożywce do zamrażania (50% płodowej surowicy bydlęcej, 40% pożywki RPMI i 10% dimetylosulfotlenku) przed przeniesieniem do fiolek kriogenicznych w 1- ml porcje. Na koniec próbki schłodzono w kriogenicznym pojemniku do kontroli szybkości do -80°C do czasu przetworzenia do cytometrii przepływowej. Po izolacji białych krwinek za pomocą wirowania w gradiencie gęstości, 1 x 106 komórek ponownie zawieszono w buforze do cytometrii przepływowej (pożywka RPMI uzupełniona 10% surowicą końską, 0,1% azydkiem sodu i 25 mM HEPES). Komórki utrwalono i permeabilizowano przy użyciu roztworu BD Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Oxford, Anglia) i zablokowano przed wewnątrzkomórkowym wybarwieniem kolagenu-I za pomocą mysiego przeciwciała przeciw ludzkiemu kolagenowi-I (Millipore, Cork, Irlandia, kod produktu MAB3391), które następnie barwiono drugorzędowym przeciwciałem kozim anty-mysim Alexa-Fluor 488 (Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, Anglia; kod produktu 115-545-146). Komórki następnie barwiono pod kątem antygenu powierzchniowego komórki CD45, stosując PerCP anty-ludzki CD45 (Biolegend, Londyn, Anglia). Następnie komórki ponownie zawieszono w PBS przed kolejną analizą na cytometrze przepływowym (BD FACSVerse). Wszystkie analizy przeprowadzono na BD FACSVerse (BD Biosciences) przy użyciu BD FACSuite v1.0.5 (BD Biosciences). Poziomy fibrocytów przedstawiono jako procent całkowitej populacji białych krwinek.

Analizy danych przeprowadzono przy użyciu IBM SPSS dla Mac OSX w wersji 25.0. Dane przedstawiono odpowiednio jako średnie i odchylenia standardowe lub mediany i przedziały międzykwartylowe. Rozkład zmiennych oceniono za pomocą histogramów, wykresów Q-Q i wykresów pudełkowych. Analiza wariancji (jednokierunkowa ANOVA) została wykorzystana do porównania różnych niezależnych grup. Test Kruskala-Wallisa zastosowano do porównania między biomarkerami i różnymi grupami (HPNG vs. HPAG vs. ADG), a dla analizy podgrup przeprowadzono porównania parami, wartość P mniejszą niż 0,05 uznano za istotną statystycznie. Krzywa charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) została wykorzystana do scharakteryzowania i porównania dokładności diagnostycznej CF, WCC, CRP, neutrofili, NLR i monocytów. Wielomianową analizę regresji logistycznej wykorzystano do oceny niezależnych predyktorów AA.