De circulerende fibrocyt - een nieuwe en nauwkeurige biomarker bij het diagnosticeren van acute appendicitis bij volwassenen

Acute appendicitis (AA) is de meest voorkomende abdominale noodsituatie. Ondanks de hoge prevalentie blijft de diagnose blindedarmontsteking een uitdaging. De klinische presentatie is vaak atypisch en de symptomen overlappen vaak met veel andere aandoeningen. In combinatie hiermee kan het niet bereiken van een snelle diagnose tot nadelige resultaten leiden.

Circulerende fibrocyten (CF's) werden voor het eerst beschreven in 1994 door Richard Bucala. Het zijn hematopoëtische cellen die zijn afgeleid van het beenmerg. Ze circuleren in de monocytenfractie en kunnen differentiëren tot myelofibrocyten, fibroblasten en adipocyten (naast andere celtypen). Ze spelen een prominente rol bij ontstekings- en genezingsprocessen en bij de ontwikkeling van fibrose.

Tot nu toe hebben geen studies de rol van CF's bij acute appendicitis onderzocht. De doelstellingen van deze klinische studie waren dus (1) om te bepalen of CF's veranderd zijn bij acute appendicitis, (2) om hun diagnostische nauwkeurigheid te beoordelen en te vergelijken met CRP, WCC, neutrofielen, lymfocyten, neutrofielen-lymfocytenratio (NLR), monocyten , basofielen en eosinofielen, en (3) om de meest betrouwbare voorspellers te bepalen bij het diagnosticeren van AA.

Er werd een prospectieve cohortstudie uitgevoerd om (1) circulerende fibrocytenspiegels (CF) te bepalen bij patiënten met histologisch bevestigde acute appendicitis (AA), en (2) om de gevoeligheid en specificiteit van circulerende CF-spiegels bij de diagnose van AA bij volwassenen te bepalen. (leeftijd ≥ 16 jaar) presenteert zich acuut met pijn in de rechter iliacale fossa, in het Universitair Ziekenhuis Limerick. De diagnose appendicitis werd bevestigd door histopathologisch onderzoek na appendicectomie.

Patiënten werden verdeeld in drie cohorten na hun definitieve diagnose bij ontslag en op basis van de histopathologische resultaten. (1) patiënten met RIFP die een appendicectomie ondergingen en een normale appendix hadden bij histologische beoordeling, d.w.z. histologisch bewezen normale appendixgroep (HPNG). (2) patiënten met RIFP die een appendicectomie ondergingen en een ontstoken appendix hadden bij histologische beoordeling, d.w.z. histologisch bewezen appendicitis-groep (HPAG). (3) patiënten met RIFP die bij ontslag een andere diagnose hadden dan appendicitis, d.w.z. alternatieve diagnosegroep (ADG). Een ander cohort werd toegevoegd als (4) gezonde controles.

De verzamelde gegevens omvatten opnamedatum, geslacht van de patiënt, leeftijd, symptomen vertonen, duur van symptomen, CF-waarden, preoperatieve WCC en de differentiëlen (neutrofielen, lymfocyten, neutrofielen-lymfocytenratio (NLR), monocyten, basofielen en eosinofielentellingen), CRP, definitieve klinische diagnose, operatie en postoperatieve diagnose op basis van histologische beoordeling.

Perifere veneuze monsters werden verkregen van patiënten in cohort 1, 2 en 3 (n=80) en gezonde controles (n=15). Een enkel monster van 10 ml gehepariniseerd veneus bloed werd verzameld via perifere venapunctie van de bovenste ledematen. Monsters werden verzameld in natriumheparine (EDTA) vacutainerbuizen en binnen 3 uur naar het laboratorium overgebracht. Monsters werden vervolgens verwerkt om de buffy coat-laag te isoleren met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie (Histopaque, Sigma-Aldrich, Wicklow, Ierland). De resulterende perifere mononucleaire bloedcellen werden vervolgens gewassen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en opnieuw gesuspendeerd in vriesmedium (50% foetaal runderserum, 40% RPMI-medium en 10% dimethylsulfoxide) voordat ze werden overgebracht naar cryogene flesjes in 1- ml aliquots. Ten slotte werden de monsters gekoeld in een container met cryogene temperatuurregeling tot -80 °C tot verwerking voor flowcytometrie. Na isolatie van witte bloedcellen met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie werden 1 x 106 cellen opnieuw gesuspendeerd in flowcytometriebuffer (RPMI-medium aangevuld met 10% paardenserum, 0,1% natriumazide en 25 mM HEPES). Cellen werden gefixeerd en gepermeabiliseerd met behulp van BD Cytofix / Cytoperm-oplossing (BD Biosciences, Oxford, Engeland) en geblokkeerd voorafgaand aan intracellulaire kleuring van collageen-I met muizen-anti-humaan collageen-I-antilichaam (Millipore, Cork, Ierland, productcode MAB3391) die werd vervolgens gekleurd met Alexa-Fluor 488 geiten-anti-muis secundair antilichaam (Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, Engeland; productcode 115-545-146). Cellen werden vervolgens gekleurd op celoppervlak-antigeen CD45 met behulp van PerCP anti-humaan CD45 (Bilegend, Londen, Engeland). Cellen werden vervolgens opnieuw gesuspendeerd in PBS vóór daaropvolgende analyse op de flowcytometer (BD FACSVerse). Alle analyses werden uitgevoerd op een BD FACSVerse (BD Biosciences) met behulp van BD FACSuite v1.0.5 (BD Biosciences). Fibrocytenniveaus werden weergegeven als een percentage van de totale populatie witte bloedcellen.

Gegevensanalyses werden uitgevoerd met behulp van IBM SPSS voor Mac OSX versie 25.0. Gegevens werden gepresenteerd als gemiddelden en standaarddeviaties, of medianen en interkwartielafstanden, naargelang het geval. De verdeling van variabelen werd beoordeeld door middel van histogrammen, QQ-plots en boxplots. Variantieanalyse (One-Way ANOVA) werd gebruikt om verschillende onafhankelijke groepen te vergelijken. De Kruskal-Wallis-test werd gebruikt om te vergelijken tussen de biomarkers en de verschillende groepen (HPNG vs. HPAG vs. ADG), en voor subgroepanalyse werden paarsgewijze vergelijkingen uitgevoerd, een P-waarde van minder dan 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. De Receiver Operating Characteristic (ROC)-curve werd gebruikt om de diagnostische nauwkeurigheid van CF's, WCC, CRP, neutrofielen, NLR en monocyten te karakteriseren en te vergelijken. Multinomiale logistische regressieanalyse werd gebruikt om onafhankelijke voorspellers voor AA te beoordelen.