Ramanova analýza slin jako biomarker CHOPN (CORSAI)

Hlavním cílem projektu je vytvořit a ověřit novou metodu založenou na Ramanově spektroskopické (RS) analýze slin pro optimalizovaný a personalizovaný management pacientů s chronickou obstrukční plicní nemocí (CHOPN). Kombinace klinických instrumentálních dat s RS přístupem zvýší kvalitu klinické praxe vhodnou stratifikací pacientů, tj. včasnou identifikací fenotypů CHOPN, následným přiřazením přesných terapií, posouzením potenciálního rizika exacerbace a adherencí k léčbě. Integrací instrumentálních a RS měření s umělou inteligencí (AI) bude predikován fenotyp CHOPN pacientů, což umožní efektivně řídit zdroje zdravotnického systému. Proveditelnost práce je potvrzena použitím citlivého, rychlého a miniaturizovaného RS, používaného nespecializovaným personálem a pro vytvoření bodu péče (POC) na dostupné biotekutině. Multidisciplinárního přístupu v oblasti preklinické, klinické a big data managementu je dosaženo díky spolupráci akademie, klinického výzkumu a průmyslu.

Počínaje nenaplněnou klinickou potřebou CORSAI vybuduje úzké propojení mezi biomedicínským výzkumem, klinickým výzkumem, datovou vědou směrem k integraci PM do klinické praxe a na etické, právní a sociální důsledky napříč zúčastněnými zeměmi i mimo ně. Hlavním cílem je sběr signálů RS ze slin pacientů s CHOPN, charakterizovaných pro stupně závažnosti a fenotypy pomocí nástrojů GERA, a odpovídajících CTRL a pacientů s astmatem (AsP). Vytvoření a korelace datového souboru povede ke splnění specifických cílů: I) Identifikace konkrétní CHOPN, CTRL a AsP RF; II) Monitorování adherence k terapii prostřednictvím signálu léku ve slinách; III) Definice fenotypů CHOPN na základě RF korelovaných s instrumentálními údaji GERA; IV) Monitorování rehabilitačních procedur a účinků; V) asociace vysokého rizika exacerbace u konkrétních pacientů s CHOPN; VI) Vytvoření klasifikačního modelu z databáze RS; VII) Aplikace vysoce výkonných výpočtů pro analýzu dat; VIII) Integrace přenosného RS jako POC. Novinka CORSAI sází na pokročilou metodologii, přenesenou na lůžko díky přenosným přístrojům. Minimálně invazivní postup použitý pro odběr slin a rychlost pro Ramanovu akvizici představují významné výhody umožňující kontinuální sledování adherence pacientů k léčbě a současné rozlišení fenotypů CHOPN s vysokou mírou exacerbací. Proveditelnost projektu přímo souvisí s biologickým vzorkem a navrhovanou technologií, již testovanou v klinickém prostředí19: i)snadný odběr a skladování slin odpovídá klinickému scénáři; ii) minimální příprava vzorku a přenosné zařízení umožňují použití POC nespecializovaným personálem s dálkovým rozhodováním AI.

ODBĚR VZORKŮ: Odběr slin od všech vybraných subjektů bude proveden podle pokynů výrobce salivette (SARSTEDT). Aby se omezila variabilita obsahu slin, která nesouvisí s CHOPN, budou sliny odebírány od všech subjektů v pevně stanovený čas, po přiměřené době od krmení a čištění zubů. Předanalytické parametry (tj. skladovací teplota a doba mezi sběrem a zpracováním), dietní a kuřácké návyky budou řádně zaznamenány. Stručně řečeno, tampon se vyjme, vloží do úst a žvýká po dobu 60 sekund, aby se stimulovalo slinění. Poté se tampon odstřeďuje po dobu 2 minut při 1000 g, aby se odstranily buněčné fragmenty a zbytky jídla. Odebrané vzorky budou skladovány při -80°C.

ZPRACOVÁNÍ VZORKU: Pro Ramanovu analýzu bude kapka každého vzorku odlita na hliníkovou fólii, aby se dosáhlo Ramanova rozptylu (SERS – Surface Enhanced Raman Scattering).

SBĚR DAT: Spektra SERS budou získána pomocí mikroskopu Aramis Raman (Horiba Jobin-Yvon, Francie) vybaveného laserovým světelným zdrojem pracujícím při 785 nm s výkonem laseru v rozmezí 25-100 % (Max. výkon 512 mW). Použije se doba akvizice mezi 10-30 sekundami. Přístroj bude před každou analýzou kalibrován pomocí referenčního pásu křemíku při 520,7 cm-1. Ramanova spektra budou shromážděna z 35 bodů po liniové mapě od okraje ke středu kapky. Spektra budou získávána v oblasti mezi 400 a 1600 cm-1 pomocí objektivu 50x (Olympus, Japonsko). Rozlišení spektra je asi 1,2 cm-1. Pro návrh map a pořizování spekter bude použit softwarový balík LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Francie).

ZPRACOVÁNÍ DAT: Všechna získaná spektra budou přizpůsobena polynomické základní linii čtvrtého stupně a normalizována jednotkovým vektorem pomocí specializovaného softwaru LabSpec 6. Z každého spektra bude odstraněn příspěvek substrátu. Statistická analýza pro ověření metody bude provedena pomocí přístupu vícerozměrné analýzy. Bude provedena analýza hlavních komponent (PCA), aby se snížily rozměry dat a prokázaly se hlavní trendy. Prvních 20 výsledných hlavních komponent (PC) bude použito v klasifikačním modelu, lineární diskriminační analýze (LDA), k rozlišení dat maximalizujícím rozptyl mezi vybranými skupinami. Bude vybrán nejmenší počet počítačů, aby se zabránilo přeplnění dat. K vyhodnocení citlivosti, preciznosti a správnosti modelu LDA bude použita křížová validace typu Leave-one-out a test matečné matice. Mann-Whitney bude proveden na skóre PC, aby se ověřily statisticky významné rozdíly mezi analyzovanými skupinami. Korelační a částečná korelační analýza bude provedena pomocí Spearmanova testu za předpokladu platné korelace pouze koeficientů s p-hodnotou nižší než 0,05. Statistická analýza bude provedena pomocí Origin2018 (OriginLab, USA).

HLOUBKOVÉ UČENÍ: Soubory dat budou analyzovány a zpracovány pomocí modelů hlubokého učení s cílem objevit významné vzorce, které lze použít k potvrzení a analýze trendů a k vytvoření předpovědí a podpory rozhodování o stratifikaci CHOPN. Budou vyvinuty techniky augmentace dat a automatické optimalizace hyperparametrů, aby se zlepšila klasifikace a zlepšila se schopnost generalizace. Aby bylo dosaženo kompromisu mezi prediktivní přesností a interpretovatelností, bude k vizualizaci aktivních proměnných ve spektrech použit přístup založený na mapování aktivace tříd (CAM), aby bylo možné identifikovat diskriminační vzor pro extrakci nejinformativnějších spektrálních rysů.

UNIMIB a GERA zavedou vysvětlovací mechanismus pro identifikaci aktivních proměnných v celém spektru a interpretaci reprezentace vnitřních rysů a potrubí transformace dat modelu CNN. UNIMIB a GERA začlení různé výpočetní moduly do modulárního výpočetního potrubí pro klasifikaci podle pacienta.