Syljen Raman-analyysi COPD:n biomarkkerina (CORSAI)

Projektin päätavoitteena on luoda ja validoida uusi menetelmä, joka perustuu syljen Raman-spektroskopian (RS) analyysiin kroonista obstruktiivista keuhkosairautta (COPD) sairastavien potilaiden optimoituun ja yksilölliseen hoitoon. Kliinisen instrumentaalisen datan yhdistäminen RS-lähestymistapaan lisää kliinisen käytännön laatua potilaiden asianmukaisen kerrostumisen kautta, eli keuhkoahtaumatautien fenotyyppien varhaisen tunnistamisen, täsmällisten hoitojen kohdistamisen, mahdollisen pahenemisriskin arvioinnin ja hoidon noudattamisen kautta. Integroimalla instrumentaali- ja RS-mittaukset tekoälyyn (AI) ennustetaan potilaiden COPD-fenotyyppi, mikä mahdollistaa terveydenhuoltojärjestelmän resurssien tehokkaan ohjauksen. Työn toteutettavuutta vahvistaa herkän, nopean ja miniatyrisoidun RS:n käyttö, jota käyttää ei-ammattihenkilöstö ja joka on tarkoitettu hoitopisteen (POC) luomiseen saatavilla olevalle bionesteelle. Monitieteinen lähestymistapa esikliinisen, kliinisen ja big datan hallinnan aloilla saavutetaan akatemian, kliinisen tutkimuksen ja teollisuuden yhteistyöllä.

Alkaen tyydyttämättömästä kliinisestä tarpeesta, CORSAI rakentaa tiiviin yhteyden biolääketieteellisen tutkimuksen, kliinisen tutkimuksen ja datatieteen välille kohti PM:n integroimista kliiniseen käytäntöön sekä eettisiä, oikeudellisia ja sosiaalisia vaikutuksia osallistujamaissa ja sen ulkopuolella. Päätavoitteena on kerätä RS-signaaleja keuhkoahtaumatautipotilaiden syljestä, jotka on karakterisoitu vaikeusasteille ja fenotyypeille GERA-instrumenteilla, ja vastaavia CTRL- ja astmapotilaita (AsP). Tietojoukon luominen ja yhdistäminen johtaa tiettyjen tavoitteiden saavuttamiseen: I) Erityisen COPD:n, CTRL:n ja AsP RF:n tunnistaminen; II) Hoitoon sitoutumisen seuranta syljen lääkesignaalin kautta; III) COPD-fenotyyppien määrittely radiotaajuuden perusteella, joka korreloi instrumentaalisten GERA-tietojen kanssa; IV) Kuntoutustoimenpiteiden ja vaikutusten seuranta; V) korkean pahenemisriskin yhdistäminen tiettyihin COPD-potilaisiin; VI) Luokittelumallin luominen RS-tietokannasta; VII) Korkean suorituskyvyn laskennan soveltaminen tietojen analysointiin; VIII) Kannettavan RS:n integrointi POC:ksi. CORSAI:n uutuus perustuu edistyneeseen metodologiaan, joka on tuotu sängyn puolelle kannettavien instrumenttien ansiosta. Minimaalisesti invasiivinen menetelmä, jota käytetään syljen keräämiseen ja nopeus Ramanin keräämiseen, edustavat olennaisia ​​etuja, jotka mahdollistavat potilaiden hoitoon sitoutumisen jatkuvan seurannan ja keuhkoahtaumatautien fenotyyppien nykyaikaisen erottelun korkealla pahenemisnopeudella. Projektin toteutettavuus liittyy suoraan biologiseen näytteeseen ja ehdotettuun teknologiaan, joka on jo testattu kliinisessä ympäristössä19: i)helppo syljen kerääminen ja varastointi sopii kliiniseen skenaarioon; ii) Minimaalinen näytteen valmistelu ja kannettava laite mahdollistavat POC:n käytön erikoistumattomille henkilöille tekoälyn etäohjausohjauksella.

NÄYTTEEN KERÄÄMINEN: Syljenkeruu kaikilta valituilta koehenkilöiltä suoritetaan Salivetten (SARSTEDT) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sylkipitoisuuden vaihtelun rajoittamiseksi, joka ei liity keuhkoahtaumatautiin, kaikilta koehenkilöiltä otetaan sylki tiettyyn aikaan sopivan viiveen jälkeen ruokinnasta ja hampaiden harjauksesta. Esianalyyttiset parametrit (esim. varastointilämpötila ja aika keräyksen ja käsittelyn välillä), ruokavalio- ja tupakointitottumukset kirjataan asianmukaisesti. Lyhyesti sanottuna vanupuikko poistetaan, laitetaan suuhun ja sitä pureskellaan 60 sekunnin ajan syljenerityksen stimuloimiseksi. Sen jälkeen vanupuikkoa sentrifugoidaan 2 minuuttia 1 000 g:ssä solufragmenttien ja ruokajätteiden poistamiseksi. Kerätyt näytteet säilytetään -80°C:ssa.

NÄYTTEEN KÄSITTELY: Raman-analyysiä varten pisara kutakin näytettä valetaan alumiinifoliolle, jotta saavutetaan Surface Enhanced Raman Scattering (SERS).

TIETOJEN KERÄÄMINEN: SERS-spektrit hankitaan Aramis Raman -mikroskoopilla (Horiba Jobin-Yvon, Ranska), joka on varustettu laservalonlähteellä, joka toimii 785 nm:ssä laserteholla 25-100 % (maksimiteho 512 mW). Hakuaikaa käytetään 10-30 sekuntia. Instrumentti kalibroidaan ennen jokaista analyysiä käyttäen piiviittanauhaa 520,7 cm-1. Raman-spektrit kerätään 35 pisteestä pisaran reunasta keskustaan ​​ulottuvan viivakartan mukaisesti. Spektrit hankitaan alueelta 400–1600 cm-1 käyttämällä 50x objektiivia (Olympus, Japani). Spektriresoluutio on noin 1,2 cm-1. Karttasuunnittelussa ja spektrien hankinnassa käytetään ohjelmistopakettia LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Ranska).

TIETOJEN KÄSITTELY: Kaikki saadut spektrit sovitetaan neljännen asteen polynomin perusviivaan ja normalisoidaan yksikkövektorilla käyttämällä erityistä LabSpec 6 -ohjelmistoa. Substraatin osuus poistetaan kustakin spektristä. Tilastollinen analyysi menetelmän validoimiseksi suoritetaan käyttämällä monimuuttujaanalyysin lähestymistapaa. Pääkomponenttianalyysi (PCA) suoritetaan tietojen mittasuhteiden pienentämiseksi ja tärkeimpien suuntausten osoittamiseksi. Ensimmäisiä 20 tuloksena olevaa pääkomponenttia (PC:tä) käytetään luokitusmallissa, Linear Discriminant Analysis (LDA) -mallissa datan erottelemiseksi ja maksimoimalla varianssin valittujen ryhmien välillä. Pienin määrä tietokoneita valitaan tietojen ylisovittamisen estämiseksi. LDA-mallin menetelmän herkkyyden, tarkkuuden ja tarkkuuden arviointiin käytetään Leave-one-out-ristivalidointia ja sekavuusmatriisitestiä. Mann-Whitney suoritetaan PC-pisteillä analysoitujen ryhmien tilastollisesti merkityksellisten erojen tarkistamiseksi. Korrelaatio- ja osittaiskorrelaatioanalyysi suoritetaan Spearmanin testiä käyttäen, kun oletetaan päteväksi korrelaatioksi vain kertoimet, joiden p-arvo on pienempi kuin 0,05. Tilastollinen analyysi suoritetaan käyttämällä Origin2018:aa (OriginLab, USA).

DEEP LEARNING: Aineistot analysoidaan ja käsitellään Deep Learning -mallien avulla. Tavoitteena on löytää merkittäviä malleja, joita voidaan käyttää trendien vahvistamiseen ja analysointiin sekä ennusteiden ja päätöstuen kehittämiseen COPD:n kerrostumisesta. Tietojen lisäyksen ja automaattisen hyperparametrien optimoinnin tekniikoita kehitetään luokittelusuorituskyvyn parantamiseksi ja yleistyskyvyn parantamiseksi. Ennustavan tarkkuuden ja tulkittavuuden välisen kompromissin saavuttamiseksi käytetään luokan aktivointikartoitus (CAM) -pohjaista lähestymistapaa spektrien aktiivisten muuttujien visualisoimiseksi, jotta voidaan tunnistaa erotteleva kuvio, jolla saadaan esiin kaikkein informatiivisimpia spektrin ominaisuuksia.

UNIMIB ja GERA toteuttavat selitysmekanismin, joka tunnistaa aktiiviset muuttujat koko spektrissä ja tulkitsee CNN-mallin sisäiset ominaisuusesitykset ja datan muunnosputket. UNIMIB ja GERA yhdistävät erilaiset laskentamoduulit modulaariseen laskennalliseen putkistoon potilaskohtaista luokittelua varten.