Analisi Raman della saliva come biomarcatore della BPCO (CORSAI)

L'obiettivo principale del progetto è quello di creare e validare un nuovo metodo basato sull'analisi della spettroscopia Raman (RS) della saliva per la gestione ottimizzata e personalizzata dei pazienti con broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). La combinazione dei dati clinico-strumentali con l'approccio RS aumenterà la qualità della pratica clinica attraverso un'adeguata stratificazione dei pazienti, ovvero l'identificazione precoce dei fenotipi della BPCO, la conseguente attribuzione di terapie precise, la valutazione del potenziale rischio di riacutizzazione e l'aderenza alla terapia. Con l'integrazione di misure strumentali e RS con l'Intelligenza Artificiale (AI), sarà previsto il fenotipo della BPCO dei pazienti consentendo di indirizzare in modo efficiente le risorse del sistema sanitario. La fattibilità del lavoro è corroborata dall'utilizzo di un RS sensibile, veloce e miniaturizzato, utilizzato da personale non specializzato e per la creazione di un point of care (POC) su un biofluido accessibile. L'approccio multidisciplinare nei campi della gestione preclinica, clinica e dei big data si ottiene attraverso la collaborazione tra accademia, ricerca clinica e industria.

Partendo dal bisogno clinico insoddisfatto, CORSAI costruirà uno stretto legame tra ricerca biomedica, ricerca clinica, scienza dei dati verso l'integrazione del PM nella pratica clinica e sulle implicazioni etiche, legali e sociali nei paesi partecipanti e oltre. L'obiettivo principale è la raccolta di segnali RS dalla saliva di pazienti con BPCO, caratterizzati per stadi di gravità e fenotipi utilizzando strumenti GERA, e corrispondenti pazienti CTRL e asmatici (AsP). La creazione e la correlazione del dataset porterà al raggiungimento di specifici obiettivi: I) Identificazione della specifica BPCO, CTRL e AsP RF; II) Monitoraggio dell'aderenza alla terapia attraverso il segnale del farmaco nella saliva; III) Definizione dei fenotipi della BPCO sulla base della RF correlata ai dati strumentali GERA; IV) Monitoraggio delle procedure e degli effetti riabilitativi; V) Associazione di un elevato rischio di riacutizzazione a specifici pazienti con BPCO; VI) Creazione di un modello di classificazione dal database RS; VII) Applicazione del calcolo ad alte prestazioni per l'analisi dei dati; VIII) Integrazione della RS portatile come POC. La novità di CORSAI risiede nella metodologia avanzata, portata al capezzale grazie a strumenti portatili. La procedura minimamente invasiva utilizzata per la raccolta della saliva e la velocità per l'acquisizione del Raman rappresentano vantaggi rilevanti che consentono il monitoraggio continuo dell'aderenza dei pazienti alla terapia e la contemporanea discriminazione dei fenotipi di BPCO con alto tasso di riacutizzazione. La fattibilità del progetto è direttamente correlata al campione biologico e alla tecnologia proposta, già testata in ambito clinico19: i) la facile raccolta e conservazione della saliva si adatta allo scenario clinico; ii) la preparazione minima del campione e il dispositivo portatile consentono l'uso del POC da parte di personale non specializzato, con guida decisionale remota AI.

RACCOLTA DEL CAMPIONE: La raccolta della saliva da tutti i soggetti selezionati verrà eseguita seguendo le istruzioni del produttore di Salivette (SARSTEDT). Per limitare la variabilità del contenuto salivare non correlato alla BPCO, la saliva verrà prelevata da tutti i soggetti ad un tempo prefissato, dopo un adeguato lasso di tempo dall'alimentazione e dallo spazzolamento dei denti. Parametri pre-analitici (es. la temperatura di conservazione e il tempo che intercorre tra la raccolta e la lavorazione), l'alimentazione e l'abitudine al fumo saranno opportunamente registrate. In breve, il tampone verrà rimosso, posto in bocca e masticato per 60 secondi per stimolare la salivazione. Quindi il tampone verrà centrifugato per 2 minuti a 1.000 g per rimuovere frammenti cellulari e residui di cibo. I campioni raccolti saranno conservati a -80° C.

PROCESSAZIONE DEL CAMPIONE: Per l'analisi Raman, una goccia di ciascun campione verrà colata su un foglio di alluminio per ottenere il Surface Enhanced Raman Scattering (SERS).

RACCOLTA DATI: Gli spettri SERS saranno acquisiti utilizzando un microscopio Aramis Raman (Horiba Jobin-Yvon, Francia) dotato di una sorgente di luce laser operante a 785 nm con potenza laser compresa tra il 25 e il 100% (potenza massima 512 mW). Verrà utilizzato un tempo di acquisizione compreso tra 10 e 30 secondi. Lo strumento verrà calibrato prima di ogni analisi utilizzando la banda di riferimento del silicio a 520,7 cm-1. Gli spettri Raman saranno raccolti da 35 punti seguendo una mappa lineare dal bordo al centro della goccia. Gli spettri saranno acquisiti nella regione tra 400 e 1600 cm-1 utilizzando un obiettivo 50x (Olympus, Giappone). La risoluzione degli spettri è di circa 1,2 cm-1. Il pacchetto software LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Francia) verrà utilizzato per la progettazione di mappe e l'acquisizione di spettri.

ELABORAZIONE DEI DATI: Tutti gli spettri acquisiti saranno adattati con una linea di base polinomiale di quarto grado e normalizzati per vettore unitario utilizzando il software dedicato LabSpec 6. Il contributo del substrato sarà rimosso da ogni spettro. L'analisi statistica per validare il metodo sarà eseguita utilizzando un approccio di analisi multivariata. Verrà eseguita l'analisi delle componenti principali (PCA) per ridurre le dimensioni dei dati e per evidenziare le principali tendenze. I primi 20 Componenti Principali (PC) risultanti saranno utilizzati in un modello di classificazione, Linear Discriminant Analysis (LDA), per discriminare i dati massimizzando la varianza tra i gruppi selezionati. Verrà selezionato il minor numero di PC per evitare l'overfitting dei dati. La validazione incrociata leave-one-out e il test della matrice di confusione saranno utilizzati per valutare la sensibilità, la precisione e l'accuratezza del metodo del modello LDA. Mann-Whitney verrà eseguito sui punteggi dei PC per verificare le differenze statisticamente rilevanti tra i gruppi analizzati. L'analisi di correlazione e di correlazione parziale sarà effettuata utilizzando il test di Spearman, assumendo come correlazione valida solo i coefficienti con p-value inferiore a 0.05. L'analisi statistica verrà eseguita utilizzando Origin2018 (OriginLab, USA).

DEEP LEARNING: i set di dati saranno analizzati ed elaborati utilizzando modelli di Deep Learning con l'obiettivo di scoprire modelli significativi che possono essere utilizzati per confermare e analizzare le tendenze e per sviluppare previsioni e supporto decisionale sulla stratificazione della BPCO. Saranno sviluppate tecniche di data augmentation e di ottimizzazione automatica degli iperparametri al fine di potenziare le prestazioni di classificazione e migliorare la capacità di generalizzazione. Al fine di raggiungere un compromesso tra accuratezza predittiva e interpretabilità, verrà applicato un approccio basato sulla mappatura di attivazione di classe (CAM) per visualizzare le variabili attive negli spettri al fine di identificare il pattern discriminante per estrarre le caratteristiche spettrali più informative.

UNIMIB e GERA implementeranno un meccanismo di spiegazione per identificare le variabili attive nell'intero spettro e interpretare le rappresentazioni delle caratteristiche interne e la pipeline di trasformazione dei dati del modello CNN. UNIMIB e GERA integreranno i vari moduli computazionali in una pipeline computazionale modulare per la classificazione in base al paziente.