Raman-analyse van speeksel als biomarker van COPD (CORSAI)

Het hoofddoel van het project is het creëren en valideren van een nieuwe methode op basis van de Raman-spectroscopie (RS)-analyse van speeksel voor een geoptimaliseerde en gepersonaliseerde behandeling van patiënten met chronische obstructieve longziekte (COPD). De combinatie van de klinische instrumentele gegevens met de RS-benadering zal de kwaliteit van de klinische praktijk verhogen door geschikte stratificatie van patiënten, d.w.z. vroege identificatie van COPD-fenotypes, consequente toekenning van precieze therapieën, beoordeling van potentieel exacerbatierisico en therapietrouw. Door de integratie van instrumentele en RS-maatregelen met kunstmatige intelligentie (AI), zal het COPD-fenotype van patiënten worden voorspeld, waardoor de middelen van het gezondheidszorgsysteem efficiënt kunnen worden ingezet. De haalbaarheid van het werk wordt bevestigd door het gebruik van een gevoelige, snelle en geminiaturiseerde RS, gebruikt door niet-gespecialiseerd personeel en voor het creëren van een point-of-care (POC) op een toegankelijke biovloeistof. De multidisciplinaire aanpak op het gebied van preklinisch, klinisch en big data management wordt bereikt door samenwerking tussen de academie, klinisch onderzoek en de industrie.

Uitgaande van de onvervulde klinische behoefte, zal CORSAI een nauwe band opbouwen tussen biomedisch onderzoek, klinisch onderzoek, datawetenschap naar de integratie van PM in de klinische praktijk en naar ethische, juridische en sociale implicaties in de deelnemende landen en daarbuiten. Het hoofddoel is het verzamelen van RS-signalen uit het speeksel van COPD-patiënten, gekarakteriseerd voor ernststadia en fenotypes met behulp van GERA-instrumenten, en overeenkomstige CTRL- en astmapatiënten (AsP). De creatie en correlatie van de dataset zal leiden tot het bereiken van specifieke doelstellingen: I) Identificatie van de specifieke COPD, CTRL en AsP RF; II) Monitoring van therapietrouw via het medicijnsignaal in speeksel; III) Definitie van COPD-fenotypes op basis van de RF gecorreleerd met instrumentele GERA-gegevens; IV) Monitoring van de revalidatieprocedures en -effecten; V) Associatie van een hoog exacerbatierisico voor specifieke COPD-patiënten; VI) Creatie van een classificatiemodel uit de RS-database; VII) Toepassing van high-performance computing voor data-analyse; VIII) Integratie van de draagbare RS als POC. De nieuwigheid van CORSAI berust op de geavanceerde methodologie, dankzij draagbare instrumenten aan de bedzijde gebracht. De minimaal invasieve procedure die wordt gebruikt voor de speekselverzameling en de snelheid voor de Raman-acquisitie vertegenwoordigen relevante voordelen waardoor de therapietrouw van patiënten continu kan worden gecontroleerd, en de hedendaagse discriminatie van COPD-fenotypes met een hoge mate van exacerbatie. De haalbaarheid van het project houdt rechtstreeks verband met het biologische monster en de voorgestelde technologie, die al in de klinische setting is getest19: i)gemakkelijke verzameling en opslag van speeksel past bij het klinische scenario; ii) minimale monstervoorbereiding en draagbaar apparaat maken POC-gebruik mogelijk door niet-gespecialiseerd personeel, met AI-beslissingsbegeleiding op afstand.

MONSTERVERZAMELING: Speekselverzameling van alle geselecteerde proefpersonen zal worden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant van Salivette (SARSTEDT). Om variabiliteit in speekselinhoud die geen verband houdt met COPD te beperken, zal speeksel van alle proefpersonen op een vast tijdstip worden verkregen, na een passende vertraging van eten en tandenpoetsen. Pre-analytische parameters (d.w.z. bewaartemperatuur en tijd tussen verzameling en verwerking), voedings- en rookgewoonten worden correct geregistreerd. In het kort wordt het wattenstaafje verwijderd, in de mond geplaatst en gedurende 60 seconden gekauwd om speekselafscheiding te stimuleren. Vervolgens wordt het wattenstaafje gedurende 2 minuten gecentrifugeerd bij 1.000 g om celfragmenten en voedselresten te verwijderen. Verzamelde monsters worden bewaard bij -80° C.

MONSTERVERWERKING: Voor de Raman-analyse wordt een druppel van elk monster op een aluminiumfolie gegoten om de Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) te bereiken.

GEGEVENSVERZAMELING: SERS-spectra zullen worden verkregen met behulp van een Aramis Raman-microscoop (Horiba Jobin-Yvon, Frankrijk) uitgerust met een laserlichtbron die werkt bij 785 nm met een laservermogen van 25-100% (max. vermogen 512 mW). Er wordt een acquisitietijd tussen 10-30 seconden gebruikt. Het instrument wordt vóór elke analyse gekalibreerd met behulp van de referentieband van silicium op 520,7 cm-1. Raman-spectra worden verzameld vanaf 35 punten volgens een lijnkaart van de rand tot het midden van de druppel. Spectra zullen worden verkregen in het gebied tussen 400 en 1600 cm-1 met behulp van een 50x objectief (Olympus, Japan). Spectra-resolutie is ongeveer 1,2 cm-1. Het softwarepakket LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Frankrijk) zal worden gebruikt voor kaartontwerp en het verzamelen van spectra.

GEGEVENSVERWERKING: Alle verkregen spectra worden aangepast aan een vierdegraads polynoombasislijn en genormaliseerd per eenheidsvector met behulp van de speciale software LabSpec 6. De bijdrage van het substraat wordt uit elk spectra verwijderd. De statistische analyse om de methode te valideren, zal worden uitgevoerd met behulp van een multivariate analysebenadering. Er zal een Principal Component-analyse (PCA) worden uitgevoerd om de gegevensdimensies te verkleinen en belangrijke trends aan te tonen. De eerste 20 resulterende Principal Components (PC's) zullen worden gebruikt in een classificatiemodel, Linear Discriminant Analysis (LDA), om de gegevens te onderscheiden en de variantie tussen de geselecteerde groepen te maximaliseren. Het kleinste aantal pc's wordt geselecteerd om overfitting van gegevens te voorkomen. Leave-one-out kruisvalidatie en verwarringsmatrixtest zullen worden gebruikt om de methodegevoeligheid, precisie en nauwkeurigheid van het LDA-model te evalueren. Mann-Whitney zal worden uitgevoerd op pc-scores om de statistisch relevante verschillen tussen de geanalyseerde groepen te verifiëren. Correlatie- en partiële correlatieanalyse zullen worden uitgevoerd met behulp van de Spearman's test, waarbij alleen de coëfficiënten met een p-waarde lager dan 0,05 als geldige correlatie worden aangenomen. De statistische analyse zal worden uitgevoerd met behulp van Origin2018 (OriginLab, VS).

DEEP LEARNING: De datasets zullen worden geanalyseerd en verwerkt met behulp van Deep Learning-modellen met als doel significante patronen te ontdekken die kunnen worden gebruikt om trends te bevestigen en te analyseren en om voorspellingen en beslissingsondersteuning over de COPD-stratificatie te ontwikkelen. Technieken voor gegevensvergroting en automatische hyperparameteroptimalisatie zullen worden ontwikkeld om de classificatieprestaties en het generalisatievermogen te verbeteren. Om een ​​afweging te maken tussen voorspellende nauwkeurigheid en interpreteerbaarheid, zal een op klasse-activering gebaseerde mapping (CAM)-benadering worden toegepast om de actieve variabelen in de spectra te visualiseren om discriminerende patronen te identificeren om de meest informatieve spectrale kenmerken te extraheren.

UNIMIB en GERA zullen een verklaringsmechanisme implementeren om de actieve variabelen in het hele spectrum te identificeren en de interne kenmerkrepresentaties en datatransformatiepijplijn van het CNN-model te interpreteren. UNIMIB en GERA zullen de verschillende rekenmodules integreren in een modulaire rekenpijplijn voor patiëntgewijze classificatie.