Raman-Analyse von Speichel als Biomarker von COPD (CORSAI)

Das Hauptziel des Projekts ist die Entwicklung und Validierung einer neuen Methode auf der Grundlage der Raman-Spektroskopie (RS)-Analyse von Speichel für die optimierte und personalisierte Behandlung von Patienten mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD). Die Kombination der klinischen Instrumentaldaten mit dem RS-Ansatz wird die Qualität der klinischen Praxis durch eine angemessene Stratifizierung der Patienten erhöhen, d. h. die frühzeitige Identifizierung von COPD-Phänotypen, die konsequente Zuordnung präziser Therapien, die Bewertung des potenziellen Exazerbationsrisikos und die Therapietreue. Durch die Integration von instrumentellen und RS-Maßnahmen mit künstlicher Intelligenz (KI) wird der COPD-Phänotyp der Patienten vorhergesagt, wodurch die Ressourcen des Gesundheitssystems effizient gesteuert werden können. Die Durchführbarkeit der Arbeit wird durch die Verwendung eines empfindlichen, schnellen und miniaturisierten RS bestätigt, der von nicht spezialisiertem Personal und für die Schaffung eines Point-of-Care (POC) auf einer zugänglichen Bioflüssigkeit verwendet wird. Der multidisziplinäre Ansatz in den Bereichen vorklinisches, klinisches und Big-Data-Management wird durch die Zusammenarbeit von Akademie, klinischer Forschung und Industrie erreicht.

Ausgehend vom ungedeckten klinischen Bedarf wird CORSAI eine enge Verbindung zwischen biomedizinischer Forschung, klinischer Forschung und Datenwissenschaft zur Integration von PM in die klinische Praxis und zu ethischen, rechtlichen und sozialen Auswirkungen in den teilnehmenden Ländern und darüber hinaus aufbauen. Das Hauptziel ist die Sammlung von RS-Signalen aus dem Speichel von COPD-Patienten, die mit GERA-Instrumenten nach Schweregraden und Phänotypen charakterisiert wurden, und entsprechenden CTRL- und Asthma-Patienten (AsP). Die Erstellung und Korrelation des Datensatzes wird zur Erfüllung spezifischer Ziele führen: I) Identifizierung der spezifischen COPD, CTRL und AsP RF; II) Überwachung der Therapietreue durch das Medikamentensignal im Speichel; III) Definition von COPD-Phänotypen auf Basis der mit instrumentellen GERA-Daten korrelierten RF; IV) Überwachung der Rehabilitationsverfahren und -effekte; V) Assoziation eines hohen Exazerbationsrisikos für bestimmte COPD-Patienten; VI) Erstellung eines Klassifikationsmodells aus der RS-Datenbank; VII) Anwendung von Hochleistungsrechnen zur Datenanalyse; VIII) Integration des portablen RS als POC. Die Neuheit von CORSAI beruht auf der fortschrittlichen Methodik, die dank tragbarer Instrumente direkt ans Krankenbett gebracht wird. Das minimalinvasive Verfahren der Speichelsammlung und die Geschwindigkeit der Raman-Akquisition stellen relevante Vorteile dar, die eine kontinuierliche Überwachung der Therapietreue der Patienten und die zeitgemäße Diskriminierung von COPD-Phänotypen mit hoher Exazerbationsrate ermöglichen. Die Durchführbarkeit des Projekts steht in direktem Zusammenhang mit der biologischen Probe und der vorgeschlagenen Technologie, die bereits im klinischen Umfeld getestet wurden19: i) Einfache Sammlung und Lagerung von Speichel passt zum klinischen Szenario; ii) minimale Probenvorbereitung und tragbares Gerät ermöglichen die POC-Nutzung durch nicht spezialisiertes Personal mit KI-Entscheidungshilfe aus der Ferne.

PROBENENTNAHME: Die Speichelsammlung von allen ausgewählten Probanden wird gemäß den Anweisungen des Herstellers der Salivette (SARSTEDT) durchgeführt. Um die Schwankungen im Speichelgehalt zu begrenzen, die nicht mit COPD zusammenhängen, wird Speichel von allen Probanden zu einem festgelegten Zeitpunkt nach einer angemessenen Verzögerungszeit von der Nahrungsaufnahme und dem Zähneputzen erhalten. Präanalytische Parameter (d.h. Lagertemperatur und Zeit zwischen Entnahme und Verarbeitung), Ernährungs- und Rauchgewohnheiten werden ordnungsgemäß aufgezeichnet. Kurz gesagt, der Tupfer wird entfernt, in den Mund genommen und 60 Sekunden lang gekaut, um den Speichelfluss anzuregen. Anschließend wird der Tupfer für 2 Minuten bei 1.000 g zentrifugiert, um Zellfragmente und Speisereste zu entfernen. Gesammelte Proben werden bei -80 °C gelagert.

PROBENVERARBEITUNG: Für die Raman-Analyse wird ein Tropfen jeder Probe auf eine Aluminiumfolie gegossen, um die oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS) zu erreichen.

DATENSAMMLUNG: SERS-Spektren werden unter Verwendung eines Aramis-Raman-Mikroskops (Horiba Jobin-Yvon, Frankreich) erfasst, das mit einer Laserlichtquelle ausgestattet ist, die bei 785 nm mit einer Laserleistung im Bereich von 25–100 % (maximale Leistung 512 mW) arbeitet. Es wird eine Erfassungszeit zwischen 10 und 30 Sekunden verwendet. Das Instrument wird vor jeder Analyse unter Verwendung der Referenzbande von Silizium bei 520,7 cm-1 kalibriert. Raman-Spektren werden von 35 Punkten gesammelt, die einer Linienkarte vom Rand bis zur Mitte des Tropfens folgen. Spektren werden im Bereich zwischen 400 und 1600 cm-1 mit einem 50x-Objektiv (Olympus, Japan) aufgenommen. Die Spektrenauflösung beträgt etwa 1,2 cm-1. Für das Kartendesign und die Aufnahme von Spektren wird das Softwarepaket LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Frankreich) verwendet.

DATENVERARBEITUNG: Alle erfassten Spektren werden mit einer polynomialen Grundlinie vierten Grades angepasst und mit der dedizierten Software LabSpec 6 durch Einheitsvektor normalisiert. Der Beitrag des Substrats wird aus jedem Spektrum entfernt. Die statistische Analyse zur Validierung der Methode wird mit einem multivariaten Analyseansatz durchgeführt. Eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) wird durchgeführt, um die Datendimensionen zu reduzieren und wichtige Trends aufzuzeigen. Die ersten 20 resultierenden Hauptkomponenten (PCs) werden in einem Klassifikationsmodell, der linearen Diskriminanzanalyse (LDA), verwendet, um die Daten zu diskriminieren und die Varianz zwischen den ausgewählten Gruppen zu maximieren. Es wird die kleinste Anzahl von PCs ausgewählt, um eine Datenüberanpassung zu verhindern. Leave-One-Out-Kreuzvalidierung und Konfusionsmatrix-Test werden verwendet, um die Empfindlichkeit, Präzision und Genauigkeit der Methode des LDA-Modells zu bewerten. Mann-Whitney wird an PC-Scores durchgeführt, um die statistisch relevanten Unterschiede zwischen den analysierten Gruppen zu überprüfen. Die Korrelations- und Teilkorrelationsanalyse wird unter Verwendung des Spearman-Tests durchgeführt, wobei nur die Koeffizienten mit einem p-Wert kleiner als 0,05 als gültige Korrelation angenommen werden. Die statistische Auswertung erfolgt mit Origin2018 (OriginLab, USA).

DEEP LEARNING: Die Datensätze werden mithilfe von Deep-Learning-Modellen analysiert und verarbeitet, mit dem Ziel, signifikante Muster zu entdecken, die zur Bestätigung und Analyse von Trends und zur Entwicklung von Vorhersagen und Entscheidungshilfen zur COPD-Stratifizierung verwendet werden können. Techniken zur Datenerweiterung und automatischen Hyperparameteroptimierung werden entwickelt, um die Klassifikationsleistung zu verbessern und die Generalisierungsfähigkeit zu verbessern. Um einen Kompromiss zwischen Vorhersagegenauigkeit und Interpretierbarkeit zu erreichen, wird ein auf Class Activation Mapping (CAM) basierender Ansatz angewendet, um die aktiven Variablen in den Spektren zu visualisieren, um diskriminierende Muster zu identifizieren und die informativsten Spektralmerkmale zu extrahieren.

UNIMIB und GERA werden einen Erklärungsmechanismus implementieren, um die aktiven Variablen im gesamten Spektrum zu identifizieren und die internen Merkmalsdarstellungen und die Datentransformationspipeline des CNN-Modells zu interpretieren. UNIMIB und GERA werden die verschiedenen Rechenmodule in eine modulare Rechenpipeline für die patientenbezogene Klassifizierung integrieren.