Raman-analys av saliv som biomarkör för KOL (CORSAI)

Huvudmålet med projektet är att skapa och validera en ny metod baserad på Raman-spektroskopi (RS) analys av saliv för optimerad och personlig hantering av patienter med kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL). Kombinationen av kliniska instrumentella data med RS-metoden kommer att öka kvaliteten på den kliniska praktiken genom lämplig stratifiering av patienter, dvs tidig identifiering av KOL-fenotyper, konsekvent tilldelning av exakta terapier, bedömning av potentiell exacerbationsrisk och följsamhet till terapi. Genom integrering av instrumentella och RS-åtgärder med artificiell intelligens (AI), kommer patienternas KOL-fenotyp att förutsägas, vilket gör det möjligt att effektivt styra hälso- och sjukvårdens resurser. Genomförbarheten av arbetet bekräftas av användningen av en känslig, snabb och miniatyriserad RS, som används av icke-specialiserad personal och för att skapa en vårdpunkt (POC) på en tillgänglig biovätska. Det multidisciplinära tillvägagångssättet inom prekliniska, kliniska och stora datahanteringsfält uppnås genom samarbete mellan akademi, klinisk forskning och industri.

Med utgångspunkt från det otillfredsställda kliniska behovet kommer CORSAI att bygga en nära koppling mellan biomedicinsk forskning, klinisk forskning, datavetenskap för att integrera PM i klinisk praxis och om etiska, juridiska och sociala implikationer i de deltagande länderna och utanför. Huvudsyftet är insamlingen av RS-signaler från saliven hos KOL-patienter, karakteriserade för svårighetsstadier och fenotyper med hjälp av GERA-instrument, och motsvarande CTRL- och astmapatienter (AsP). Skapandet och korrelationen av datasetet kommer att leda till att specifika mål uppnås: I) Identifiering av den specifika KOL, CTRL och AsP RF; II) Övervakning av terapividhäftning genom läkemedelssignalen i saliv; III) Definition av KOL-fenotyper på basen av RF korrelerad med instrumentella GERA-data; IV) Övervakning av rehabiliteringsprocedurerna och effekterna; V) Förening av en hög exacerbationsrisk för specifika KOL-patienter; VI) Skapande av en klassificeringsmodell från RS-databasen; VII) Tillämpning av högpresterande beräkningar för dataanalys; VIII) Integration av den bärbara RS som POC. Det nya med CORSAI bygger på den avancerade metoden, som förs till sängsidan tack vare bärbara instrument. Den minimala invasiva proceduren som används för salivinsamlingen och hastigheten för Raman-förvärvet representerar relevanta fördelar som möjliggör kontinuerlig övervakning av patienternas efterlevnad av terapi och den moderna diskrimineringen av KOL-fenotyper med hög exacerbationshastighet. Projektets genomförbarhet är direkt relaterad till det biologiska provet och den föreslagna tekniken, som redan testats i den kliniska miljön19: i) enkel insamling och lagring av saliv passar det kliniska scenariot; ii) minimal provberedning och bärbar enhet möjliggör POC-användning av icke-specialiserad personal, med AI fjärrstyrd beslutsvägledning.

PROVINSAMLING: Salivuppsamling från alla utvalda försökspersoner kommer att utföras enligt Salivette (SARSTEDT) tillverkarens instruktioner. För att begränsa variationen i salivinnehåll som inte är relaterat till KOL, kommer saliv att tas från alla försökspersoner vid en bestämd tid, efter en lämplig fördröjningstid från matning och tandborstning. Preanalytiska parametrar (dvs. lagringstemperatur och tid mellan insamling och bearbetning), kommer kost- och rökvanor att registreras korrekt. Kortfattat kommer pinnen tas bort, placeras i munnen och tuggas i 60 sekunder för att stimulera salivutsöndring. Sedan kommer provtagningspinnen att centrifugeras i 2 minuter vid 1 000 g för att avlägsna cellfragment och matrester. Insamlade prover kommer att förvaras vid -80°C.

PROVBEHANDLING: För Raman-analysen kommer en droppe av varje prov att gjutas på en aluminiumfolie för att uppnå Surface Enhanced Raman Scattering (SERS).

DATAINSAMLING: SERS-spektra kommer att förvärvas med hjälp av ett Aramis Raman-mikroskop (Horiba Jobin-Yvon, Frankrike) utrustat med en laserljuskälla som arbetar vid 785 nm med lasereffekt som sträcker sig från 25-100 % (Max effekt 512 mW). Insamlingstid mellan 10-30 sekunder kommer att användas. Instrumentet kommer att kalibreras före varje analys med hjälp av referensbandet av kisel vid 520,7 cm-1. Raman-spektra kommer att samlas in från 35 punkter efter en linjekarta från kanten till mitten av droppen. Spectra kommer att förvärvas i regionen mellan 400 och 1600 cm-1 med ett 50x objektiv (Olympus, Japan). Spektraupplösningen är cirka 1,2 cm-1. Mjukvarupaketet LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Frankrike) kommer att användas för kartdesign och förvärv av spektra.

DATABEHANDLING: Alla förvärvade spektra kommer att passa med en fjärdegrads polynombaslinje och normaliseras med enhetsvektor med hjälp av den dedikerade programvaran LabSpec 6. Bidraget från substratet kommer att tas bort från varje spektra. Den statistiska analysen för att validera metoden kommer att utföras med hjälp av en multivariat analysmetod. Principal Component Analysis (PCA) kommer att utföras för att minska datadimensionerna och för att bevisa stora trender. De första 20 resulterande huvudkomponenterna (PC) kommer att användas i en klassificeringsmodell, Linear Discriminant Analysis (LDA), för att särskilja data för att maximera variansen mellan de valda grupperna. Det minsta antalet datorer kommer att väljas för att förhindra att data överanpassas. Lämna-en-ut korsvalidering och förvirringsmatristest kommer att användas för att utvärdera metodens känslighet, precision och noggrannhet hos LDA-modellen. Mann-Whitney kommer att utföras på PCs poäng för att verifiera skillnaderna statistiskt relevanta mellan de analyserade grupperna. Korrelations- och partiell korrelationsanalys kommer att utföras med användning av Spearmans test, med antagande som giltig korrelation endast koefficienter med ett p-värde lägre än 0,05. Den statistiska analysen kommer att utföras med Origin2018 (OriginLab, USA).

DEEP Learning: Datauppsättningarna kommer att analyseras och bearbetas med hjälp av Deep Learning-modeller i syfte att upptäcka betydande mönster som kan användas för att bekräfta och analysera trender och för att utveckla förutsägelser och beslutsstöd om KOL-stratifieringen. Tekniker för dataökning och automatisk hyperparameteroptimering kommer att utvecklas för att förbättra klassificeringsprestanda och förbättra generaliseringsförmågan. För att nå en avvägning mellan prediktiv noggrannhet och tolkningsbarhet kommer en klassaktiveringsmappning (CAM)-baserad metod att tillämpas för att visualisera de aktiva variablerna i spektra för att identifiera diskriminerande mönster för att extrahera de mest informativa spektrala egenskaperna.

UNIMIB och GERA kommer att implementera en förklaringsmekanism för att identifiera de aktiva variablerna i hela spektrumet och tolka CNN-modellens interna funktionsrepresentationer och datatransformationspipeline. UNIMIB och GERA kommer att integrera de olika beräkningsmodulerna i en modulär beräkningspipeline för patientmässig klassificering.